论文摘要
人可溶性增殖诱导配体（hsAPRIL）是TNF家族的一个较新的成员，它与人B淋巴细胞刺激因子（hBAFF）同属肿瘤坏死因子超家族的成员，且在该家族中两者最为接近。本文从人外周血液总RNA中克隆出hsAPRIL cDNA，利用pET-30a这一原核表达载体成功构建并表达了hsAPRIL蛋白，在对其进行变复性后得到了其活性蛋白，并进行细胞活性鉴定，证明所得到的确为其活性形式。另一方面以APRIL蛋白为抗原免疫实验兔，通过心脏取血从血清中得到其抗体，并通过饱和硫酸铵沉淀法以及Protein-A凝胶柱纯化该抗体，利用western blotting鉴定抗体，后以ELISA来测定该多抗的效价。实验设计及结果如下：1 hsAPRIL cDNA基因的钓取，蛋白的表达、纯化及活性鉴定利用RT-PCR技术从健康人新鲜外周血中钓出增殖诱导配体基因，将其克隆于原核表达载体后，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达目的蛋白，并通过Ni-IDA亲和层析柱对该蛋白进行纯化，纯化后的蛋白通过透析变复性后得到有活性蛋白，再利用其促进肿瘤细胞增殖这一特性来鉴定其活性。2 hsAPRIL多克隆抗体的制备及纯化将已制备好的抗原每隔10-15天免疫试验兔，在第三次免疫后从兔耳静脉取血，测其效价。在确定多抗确有其特异性后从心脏取血得到抗血清。在利用饱和（NH4）SO4沉淀法将抗血清初步纯化后再利用Ptotein-A亲和层析柱对其进一步纯化。纯化产物用western blotting以及ELISA检测和测定其效价。
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摘要Abstract引言第一部分 文献综述第一章 人增殖诱导抗体（hAPRIL）的研究进展1 APRIL的发现1.1 APRIL的基因以及蛋白结构1.2 APRIL的结构形式1.3 APRIL的受体2 APRIL的生物学功能2.1 APRIL及其受体的表达2.2 APRIL在体外对B细胞的作用2.3 APIRL在体外对其他细胞的作用2.4 APRIL的体内活性3.APRIL在自身免疫性疾病和癌瘤中的作用3.1 APRIL与自身免疫3.2 APRIL与恶性肿瘤4 治疗途径参考文献第二章 抗体的研究进展1 抗体的发展历程2 抗体的结构与生物学活性2.1 抗体的结构2.2 抗体的生物学活性3 抗体的分类3.1 多克隆抗体3.2 单克隆抗体3.3 基因工程抗体4 抗体的应用4.1 用于基础研究4.2 用于临床诊断5 展望参考文献第三章 巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）的研究进展1、P.pastoris宿主菌2 酵母表达载体2.1 载体的结构特点2.2 载体的类型2.3 载体的选择标志3 外源蛋白在毕赤酵母中的表达3.1 异源蛋白在酵母中表达的一般步骤3.2 重组蛋白的翻译后修饰4 应用前景及局限性第二部分 实验内容第四章 人可溶性增殖诱导配体在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定1 实验材料1.1 实验材料和试剂1.2 主要实验仪器1.3 主要试剂配制2 实验设计3 实验方法3.1 人APRIL基因的钓取3.2 RT-PCR扩增人sAPRIL cDNA:3.3 DNA的克隆及序列测定3.4 菌落PCR鉴定及基因序列的测定3.5 重组人APRIL（rhsAPRIL）的表达、鉴定和纯化3.6 重组人APRIL（rhsAPRIL）的变复性及生物活性鉴定4 实验结果4.1 RT-PCR扩增人sAPRIL cDNA4.2 rhsAPRIL cDNA的克隆及序列测定4.3 rhsAPRIL的表达及鉴定4.4 rhsAPRIL的纯化及复性5 讨论参考文献第五章 抗hsAPRIL多克隆抗体的制备与鉴定1 实验材料2 实验方法2.1 抗原的制备2.2 抗体的制备3 实验结果3.1 抗血清的制备3.2 抗血清的效价3.3 APRIL抗体的纯化3.4 APRIL抗体的浓度3.5 APRIL抗体的鉴定4 讨论第六章 人BAFF单链抗体（scfv）在毕赤酵母中的克隆及表达1 实验材料1.1 实验材料和试剂1.2 实验仪器2 实验设计3 实验方法3.1 引物的设计3.2 PCR合成基因3.3 质粒pPICZαA的提取与纯化3.4 用Pme Ⅰ& XbaⅠ于37℃双酶切PCR产物和pPICZαA,并将之纯化回收3.5 连接3.6 转化3.7 菌落PCR鉴定及测序3.8 宿主菌的转化4 实验结果5 讨论致谢附1
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标签：人增殖诱导配体论文; 肿瘤坏死因子论文; 大肠杆菌论文; 细胞增殖论文; 多克隆抗体论文;
人可溶性增殖诱导配体的表达、纯化、活性鉴定以及抗体的制备
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