茶皂甙的酶解及产物结构分析

论文摘要

本论文以提高茶皂甙的生物活性为目的，采用生物转化的方法改变茶皂甙的结构以获得高活性的茶皂甙。研究中采用AB-8大孔树脂提取和纯化茶皂甙，通过四因素四水平正交试验设计研究了茶皂甙生物转化的最佳条件，采用薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）对酶解前后的皂甙进行分析，通过超高压液相色谱-质谱联用技术（LC-Q-TOF-MS/MS）对酶解后的皂甙进行结构鉴定。在AB-8大孔树脂纯化茶皂甙过程中，考察了洗脱剂浓度和碱液浓度对皂甙洗脱效果的影响。用不同浓度的NaOH溶液除杂，不同浓度的乙醇洗脱，通过分光光度计检测所提取的茶皂甙的纯度，通过考察茶皂甙的回收率和纯度确定最佳的碱液浓度和洗脱剂浓度，最终选取最佳碱液浓度为0.1%，最佳洗脱剂浓度80%。考察了Aspergillus niger48s水解茶皂甙的反应条件，通过正交实验最终确定最佳反应条件为反应温度45℃，底物浓度6mg/ml,pH值6，反应时间10h。对酶解前后皂甙进行TLC分析，选择展开剂为氯仿：甲醇：水=7.4：2.6：1，得到迁移率分别为0.73、0.65、0.47、0.44四种新皂甙，进一步采用HPLC分析验证酶解后有新皂甙产生。为了进一步确定酶解后产生新皂甙的结构，分别对酶解前后的皂甙溶液做LC-MS/MS检测，检测出并确定油茶中茶皂甙分子量为1120、1262、1232、1190、1202等5种茶皂甙，分别为脱氢山茶皂甙B、茶皂甙A5、茶皂甙A2、茶皂甙A1和山茶皂B1。同时，在酶解产物中检测到2种分子量分别为981和967的低糖链茶皂甙。通过与已有皂甙对比及二级质谱（MS/MS）分析发现分子量为981和967的皂甙为新皂甙，其结构分别为：分子量981新皂甙分子式为C49O22H73，是3-氧-[β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-（1-2）-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-当归酸基-28-乙酸基-茶皂甙元A。推测该皂甙是茶皂甙A2酶解掉一分子木糖、一分子阿拉伯糖和一分子半乳糖后又结合了一分子的葡萄糖醛酸生成的新皂甙，或者是茶皂甙A5酶解掉一分子木糖、一分子葡萄糖和一分子半乳糖后又结合了一分子的葡萄糖醛酸；分子量为967的皂甙分子式为C49O19H75，是3-氧-[-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-（1-2）-β-D-吡喃半乳糖基]-21-当归酸-28-乙酸-茶皂甙元A。推测该皂甙是茶皂甙A5失去一分子葡萄糖和一分子阿拉伯糖得到的新皂甙或者茶皂甙A2失去一分子木糖和一分子阿拉伯糖得到的新皂甙。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 茶皂甙的化学结构及组织分布
• 1.1.1 茶皂甙的化学结构
• 1.1.2 茶皂甙的组织分布
• 1.2 茶皂甙的理化性质
• 1.3 茶皂甙的生物活性研究
• 1.3.1 茶皂甙混合物的生物活性研究
• 1.3.1.1 溶血作用和鱼毒活性
• 1.3.1.2 抗菌活性
• 1.3.1.3 抗炎与抗氧化作用
• 1.3.2 茶皂甙单体的生物活性研究
• 1.3.2.1 抑制酒精吸收和保护肠胃的作用
• 1.3.2.2 抗高血脂、高血压的作用
• 1.3.2.3 其他
• 1.4 茶皂甙的应用
• 1.4.1 在农药行业的应用
• 1.4.2 在纺织行业上的应用
• 1.4.3 在医药上的应用
• 1.4.4 在养殖上的应用
• 1.4.5 在建材上的应用
• 1.4.6 在日用化工上的应用
• 1.4.7 在食品上的应用
• 1.5 茶皂甙的提取方法
• 1.5.1 水提法
• 1.5.2 有机溶剂提取法
• 1.5.3 混合溶剂提取法
• 1.6 茶皂甙的纯化方法
• 1.6.1 沉淀法
• 1.6.2 大孔吸附树脂层析
• 1.6.3 大孔吸附树脂层析
• 1.6.4 膜过滤法
• 1.7 定量分析方法的研究
• 1.8 茶皂甙糖链的修饰
• 1.8.1 茶皂甙糖链修饰与生物活性的关系
• 1.8.2 去掉糖基以提高生物活性的研究进展
• 1.9 本论文研究的内容
• 第二章 实验方法
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 粗油茶皂甙
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 粗油茶皂甙的纯化方法
• 2.2.1.1 AB-8 大孔吸附树脂柱的预处理及使用流程
• 2.2.1.2 茶皂甙的粗提取
• 2.2.1.3 茶皂甙纯化条件的确定
• 2.2.1.4 茶皂甙含量的测定
• 2.2.1.5 茶皂甙的标准曲线
• 2.2.2 菌种的斜面培养
• 2.2.2.1 培养基的制备
• 2.2.2.2 接菌
• 2.2.2.3 菌种的培养
• 2.2.3 菌种的扩培
• 2.2.4 缓冲液的制备
• 2.2.5 粗酶液的提取及酶活力测定
• 2.2.5.1 粗酶液的提取
• 2.2.5.2 酶活力的测定
• 2.2.6 最适酶解条件的研究
• 2.2.7 茶皂甙的酶解
• 2.2.8 TLC 分析方法
• 2.2.9 展开剂的选择
• 2.2.10 HPLC 分析方法
• 2.2.11 LC-Q-TOF-MS 分析方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 AB-8 大孔吸附树脂纯化油茶皂甙的研究
• 3.1.1 标准曲线的绘制
• 3.1.2 茶皂甙纯化条件的研究
• 3.2 TLC 展开剂的选择
• 3.3 茶皂甙最适酶解条件
• 3.3.1 水解茶皂甙酶性质的研究
• 3.3.2 最佳酶解条件的正交实验设计
• 3.3.3 最佳酶解反应条件的选择结果
• 3.4 茶皂甙的 TLC 分析
• 3.5 茶皂甙的 HPLC 分析
• 3.6 茶皂甙及其酶解产物的 LC-Q-TOF-MS 分析
• 3.6.1 酶解前茶皂甙的 LC-MS 分析和 MS/MS 分析
• 3.6.1.1 酶解前茶皂甙的 LC-MS 分析
• 3.6.1.2 酶解前茶皂甙的 MS/MS 分析
• 3.6.2 酶解后茶皂甙的 LC-MS 和 MS/MS 分析
• 3.6.2.1 酶解后茶皂甙的 LC-MS 分析
• 3.6.2.2 酶解后茶皂甙的 MS/MS 分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢