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猪圆环病毒2型主要蛋白表达及ORF1基因T细胞表位优势区域鉴定

2020-12-08阅读(161)

猪圆环病毒2型主要蛋白表达及ORF1基因T细胞表位优势区域鉴定

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine corcirvirus type 2, PCV2）引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾炎综合征、先天性震颤等多种疾病,临床表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疸和腹泻等症状,造成淋巴细胞减少和淋巴组织细胞侵润等特征性组织病变,给世界养猪业造成极大的损失。PCV2病毒蛋白主要包括ORF1、ORF2、ORF3编码蛋白,其中ORF1编码的非结构蛋白Rep蛋白高度保守。确定T细胞表位对于研究细胞免疫机理、过程以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意义。目前,关于PCV2 T细胞表位研究还不清楚,对PCV2病毒蛋白表达,明确Rep蛋白T细胞表位优势区域进而精确定位,对新型疫苗研制和疫病防控具有重要意义。本论文主要研究内容如下：1.PCV2江苏分离株主要开放阅读框真核表达质粒的构建PCV2江苏分离毒株用PK-15细胞增殖。针对该毒株ORF1、ORF2和ORF3基因PCR扩增,连接到pMD18-T载体,测序比较与JS2003株同源性98%,分别成功构建真核表达载体pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2和pcDNA-ORF3.IFA、RT-PCR鉴定结果表明,所构建的重组质粒在真核细胞293A中分别表达出目的蛋白,Western Blot分析证实,针对PCV2猪阳性血清,Rep蛋白、Cap蛋白具有抗原性,ORF3抗原性不明显。2.PCV2 ORFl基因表位预测及分段原核表达运用两种计算机软件对PCV2 ORF1基因进行表位预测,均发现TLLESGSLV（125-133aa）、ALYRRITSL （273-281aa）和HLQGFANFV （57-65aa）三个9肽片段与MHC I类分子的结合力最强。以该结果为线索,以pcDNA-ORF1为模板,将Rep基因亚克隆为6段：ORF11-60 aa、ORF151-110aa、ORF1101-160aa、ORF1 151-210aa、ORF1201-260aa和ORF1251-314aa。每个片段包括60aa,相互间重叠10个aa,计算机预测得到的3个表位分别位于第3、6和2段。将亚克隆基因分别连入原核表达载体pET-32a中进行表达,WesternB1ot证实各段蛋白均有抗原性,重组蛋白镍柱吸附,用肠激酶柱上酶切,获得大小约7.8kd的酶切纯化小分子多肽。3 PCV2 Rep蛋白T细胞表位优势区域定位用pcDNA-ORF1真核质粒3次免疫小鼠,IFA监测血清抗体,结果表明在2免、3免后14d抗体水平较高。IPMA细胞中和试验表明,针对Rep蛋白的抗体对PCV2没有中和活性。3免后分离获取小鼠脾淋巴细胞,与酶切回收小蛋白作用,用Monensin阻断细胞内细胞因子分泌,流式细胞仪三色标记法检测CD3+／CD8+／IFN-γ用于检测Th1,Tc1细胞,CD3+／CD8+／IL-4用于检测Th2,Tc2细胞。结果表明,与PBS对照组相比,所有经蛋白刺激后的淋巴细胞均有不同程度的淋巴增殖,细胞因子分泌现象,第3段和第6段蛋白的CD8+细胞比例显著增加,IFN-γ+细胞增加而IL-4+细胞减少,说明这两段多肽为CD8表位优势区,并且为Tcl型。该结果与计算机编制预测结果相符,为PCV2 Rep蛋白T细胞表位精确定位奠定基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略词表
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 猪圆环病毒的研究进展
  • 1 猪圆环病毒的发现与分类地位
  • 2 猪圆环病毒流行病学
  • 3 分子生物学研究进展
  • 4 猪圆环病毒检测方法的研究进展
  • 5 PCV相关性疾病的研究
  • 6 PCV对免疫系统的影响
  • 7 防治进展
  • 参考文献
  • 第二章 T细胞表位的研究进展
  • 1 T细胞发育过程
  • 2 常用的辅助分子及细胞因子
  • 3 表位
  • 4 T表位预测
  • 5 表位疫苗
  • 6 PCV的抗原表位的研究进展
  • 7 结语
  • 参考文献
  • 第三章 流式细胞术及三色免疫荧光检测细胞内细胞因子的研究进展
  • 1 流式细胞术的研究进展
  • 2 细胞因子简介
  • 3 流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
  • 4 展望
  • 参考文献
  • 第二部分 研究内容
  • 第四章 PCV2江苏分离株主要开放阅读框真核表达质粒构建
  • 1. 材料与方法
  • 2. 结果
  • 3. 讨论
  • 参考文献
  • 第五章 猪圆环病毒2型ORF1基因表位预测及分段原核表达
  • 1 材料与方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 第六章 猪圆环病毒2型ORF1基因T细胞表位优势区域定位
  • 1 材料与方法
  • 2 结果
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 致谢
  • 附录:常用试剂的配制

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