论文摘要
背景和目的：和厚朴酚是中药厚朴的主要化学成分。据报道：和厚朴酚具有多途径抗肿瘤机制，如诱导细胞增殖与分化，引起细胞凋亡，其机制与上调促凋亡因子Bid、下调抑凋亡因子Bcl-XL，以及激活p53非依赖、线粒体依赖的Caspase通路有关。由于动物实验需要，我们需要找到一种高效快速的分离技术纯化出大量的和厚朴酚，高速逆流色谱仪是一种液液分离装置，经过多年的改进，发展为一种快速的分离技术，可以和高效液相色谱媲美，是一种分离天然药物的理想的设备。SILAC技术：即是用同位素标记必需氨基酸，将它加到缺乏此氨基酸的培养基，用此培养基培养细胞，经过细胞代谢，标记的氨基酸融合到蛋白中，形成内码子。它与质谱结合，为定量蛋白组提供了和好的技术。本文旨在用高速逆流色谱从植物厚朴中大规模分离和厚朴酚，并利用SILAC技术，将和厚朴酚治疗同位素标记的肝癌细胞HepG2，通过质谱鉴定，用定量蛋白组的方法鉴定出和厚朴酚引起的蛋白调控，从而确定出和厚朴酚抗肿瘤的作用机理。方法：使用英国布鲁内尔提供的分析型HSCCC优化分离的条件，包括流速、进样浓度、进样量。并将优化的条件放大到制备型HSCCC。大规模分离纯化出和厚朴酚。用和厚朴酚治疗经亮氨酸—d3完全标记的肝癌细胞HepG2，提取蛋白，利用质谱检测总蛋白，以保守蛋白β-actine为标准，确定出和厚朴酚引起调控的蛋白。推断出和厚朴酚抗肿瘤作用机理。结果：经分析型HSCC优化，逆流色谱分离的条件为：转速为每分钟1800转；流速为每分钟2.5毫升；进样量为分离柱的5％；进样浓度为每毫升80毫克。这些优化的条件成功的运用到制备型高速逆流色谱。在大规模分离纯化和厚朴酚与厚朴酚中，我们用三种不同的浓度（20mg/ml，75mg/ml，250mg/ml）进样，从59.2克粗品中分离出纯度高达99.9％的厚朴酚24.7克与纯度高达98.6％的和厚朴酚23.2克。我们用10μg/ml浓度和厚朴酚作用HepG2细胞24h。通过质谱鉴定了290个蛋白，其中和厚朴酚引起蛋白上调占了5.5％，下调蛋白占了72.4％；与细胞凋亡相关的蛋白有23个。结论：本文中，我们成功利用了HSCCC大规模纯化和厚朴酚。采用SILAC技术，我们发现了和厚朴酚引起的蛋白调控，其中在与细胞凋亡相关的蛋白中，我们选择Ras GTPase-activating-iike protein IQGAP1（p195）与94kDa glucose-regulated protein（GRP94）进行PCR与Westen-blot验证。证实了和厚朴酚可能通过引起一系列的蛋白调控来诱导细胞的凋亡。