粉棒束孢蛋白酶的克隆、表达及两种蛋白酶的诱导转录的研究

论文摘要

虫生真菌作为重要的天敌生物资源，具有广阔的应用前景，尤其是其可贵的流行潜力始终吸引着人们，同时虫生真菌还是害虫的自然控制因子和重要的生物防治材料。粉棒束孢（Isaria farinosa）是一类较常见的世界性分布的虫生真菌，其寄主广泛，由于粉棒束孢适宜于低温下的生长发育和侵染致病，因此较白僵菌和绿僵菌而言，对害虫越冬种群的防治有着独特的优势。然而它也有着虫生真菌的通病，如对环境温、湿度要求高、耐储藏性差、适应环境能力弱、致死慢和防效不稳定，因此这也严重影响了它的广泛应用和商品化生产。根据黄勃等RACE法得到的cDNA序列（pr1H），运用PCR技术与DNA步移技术，从粉棒束孢中克隆出类枯草杆菌蛋白酶的结构基因及其上游序列（命名为：IfPrU，GenBank登录号：GQ505371）。结构基因总长1650bp，扩出的结构基因DNA与其cDNA比较在距离起始密码子369bp处有一个内含子，大小为51bp。通过DNA步移技术得到的上游序列大小为3189bp，与cDNA相互重叠的部分为352bp。分析表明该基因转录起始位点位于2838bp的A碱基处，上游序列中没有明显的TATA-盒和CAAT-盒，但含有GC-box、热激转录因子（HSF）等重要的转录因子结合位点，以及GATA等启动子顺式调控元件。通过SMART RACE RT-PCR技术从粉棒束孢中克隆出另外一个蛋白酶基因的cDNA序列（命名为：Ifpr1，GenBank登录号为：JN014832），并通过DNA步移技术获得了它的上游启动子序列（命名为：Ifpr1-up，GenBank登录号：JN014833）。序列分析表明：该基因cDNA全长1288bp，5’端非翻译区84bp，3’端非翻译区244bp，开放阅读框（ORF）960bp，编码319个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为33.2kDa，理论等电点为7.39，Ifpr1蛋白酶信号肽由20个氨基酸组成。得到的上游序列长度1790bp中有309bp序列与cDNA序列重叠。分析表明，该上游序列的转录起始位点位于第1482位A碱基处，没有明显的TATA-box和CAAT-box，但含有GC-box转录因子结合位点，以及热激应答元件HSF和GATA元件等启动子顺式调控元件。通过Realtime-PCR技术，对粉棒束孢pr1H和Ifpr1在蝉蜕诱导培养的条件下进行比较研究，从mRNA转录水平探讨这两个基因在不同诱导时间段（12h-60h）的表达情况。结果表明，在经过蝉蜕诱导后它们的表达量都大大提高，其中Ifpr1诱导后的表达最为明显，是诱导前的2.97×105倍。因此，推测这两种蛋白酶属于诱导性酶，且Ifpr1可能是该粉棒束孢菌株蛋白酶类的主效基因，在菌株侵染过程中起主要作用。将克隆得到的粉棒束孢Ifpr1基因连接到分泌性表达载体pPIC9K上后，通过电转化，转入毕赤酵母GS115。经甲醇诱导获得了约50KDa左右的表达蛋白，大于其理论预测值，这可能是由于巴斯德毕赤酵母对表达蛋白进行糖基化修饰的结果。同时，酶活测定结果表明，表达蛋白具有蛋白酶生物活性，诱导的粗酶液酶活最高达到26.9U/ml。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 附图清单
• 附表清单
• 主要缩略词和符号表
• 1 文献综述
• 1.1 真菌杀虫剂的特点和发展前景
• 1.1.1 真菌杀虫剂的特点
• 1.1.2 真菌杀虫剂发展前景
• 1.2 真菌杀虫剂功能基因研究
• 1.3 真菌蛋白酶研究进展及分类
• 1.3.1 真菌蛋白酶研究进展
• 1.3.2 真菌蛋白酶分类
• 1.3.3 真菌蛋白酶在昆虫体壁中的侵染机制
• 1.4 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白
• 1.4.1 巴斯德毕赤酵母研究进展
• 1.4.2 巴斯德毕赤酵母的优点
• 1.5 基因染色体步移技术研究进展及应用
• 1.5.1 基因染色体步移技术研究进展
• 1.5.2 基因染色体步移技术应用
• 1.5.3 基因染色体获取上游序列的意义
• 1.6 荧光定量 PCR 作用原理及应用
• 1.6.1 定量 PCR 研究进展
• 1.6.2 荧光定量 PCR 作用原理
• 1.6.3 荧光定量 PCR 应用
• 1.7 虫生真菌基因工程研究进展
• 1.8 虫生真菌研究展望
• 2 引言
• 2.1 研究目的意义
• 2.2 主要研究内容
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 主要试剂配方
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粉棒束孢菌丝的培养与 DNA 和 RNA 的获取与检测
• 3.2.2 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶结构基因的克隆
• 3.2.3 PCR 产物的回收、克隆及测序
• 3.2.4 DNA 步移法扩增粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 pr1H 基因上游序列
• 3.2.5 序列及进化分析
• 3.2.6 cDNA 第一链的合成
• 3.2.7 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 特异片段的扩增
• 3.2.8 粉棒束孢蛋白酶基因 Ifpr1 cDNA 的 3/5’RACE 扩增
• 3.2.9 粉棒束孢蛋白酶基因 Ifpr1 cDNA 全长、结构基因及上游序列克隆
• 3.2.10 粉棒束孢蛋白酶基因 pr1 和 Ifpr1 在诱导培养条件下的表达差异
• 3.2.11 粉棒束孢蛋白酶基因 Ifpr1 的真核表达载体 pPIC9K/ Ifpr1 的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶结构基因与上游序列的克隆与分析
• 4.1.1 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶结构基因的克隆与分析
• 4.1.2 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶基因 pr1H 上游序列的克隆与分析
• 4.2 粉棒束孢 Ifpr1 cDNA 的特异片段扩增
• 4.3 粉棒束孢 Ifpr1 基因 cDNA 的 3/5’RACE 扩增
• 4.4 Ifpr1 基因及其编码的氨基酸的特征分析
• 4.4.1 Ifpr1 基因序列分析
• 4.4.2 Ifpr1 基因氨基酸序列分析
• 4.5 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶基因 Ifpr1 上游序列的克隆与分析
• 4.6 不同诱导条件下蛋白酶表达分析
• 4.6.1 Realtime-PCR 标准曲线的获得
• 4.6.2 不同时间段蝉蜕诱导诱导条件下 pr1H 的表达
• 4.6.3 不同时间段蝉蜕诱导诱导条件下 Ifpr1 的表达
• 4.6.4 pr1H 与 Ifpr1 诱导前后表达量的比较
• 4.7 粉棒束孢蛋白酶基因 Ifpr1 酵母表达分析
• 4.7.1 粉棒束孢蛋白酶基因真核表达载体 pPIC9K/Ifpr1 的构建
• 4.7.2 含高拷贝 Ifpr1 基因的重组毕赤酵母转化子的 G418 抗性筛选
• 4.7.3 重组毕赤酵母工程菌株外源基因蛋白的表达及 SDS-PAGE 检测
• 4.7.4 表达产物酶活检测
• 5 讨论
• 5.1 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 的研究及蛋白酶研究
• 5.2 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶上游序列的作用及规律
• 5.3 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶在不同培养条件下的表达情况
• 5.4 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 的真核表达研究
• 6 结论
• 6.1 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 pr1H 上游序列分析
• 6.2 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 特异片段及全长的获取
• 6.3 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 上游序列分析
• 6.4 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 pr1 与 Ifpr1 的定量表达
• 6.5 粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶 Ifpr1 真核表达结果
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文