论文摘要
肌萎缩侧索硬化（ALS）是选择性侵犯上、下运动神经元的慢性进行性变性疾病。目前ALS的病因及发病机制尚不十分清楚,推测有以下几种:线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集、兴奋毒作用、轴浆运输障碍、氧化应激、生长因子缺乏和炎症等。各种发病因素并非独立存在,而是相互作用、相互影响,共同参与了疾病的发生发展。近年来越来越多的证据显示,运动神经元的选择性丢失并非细胞自主性的（non-cell-autonomous）,胶质细胞的功能状态及炎症反应在ALS的疾病进程中发挥着关键作用。研究发现,在ALS病人和转基因动物模型中,存在大量激活的小胶质细胞、反应性星形胶质细胞、炎性细胞因子以及趋化因子等,并且小胶质细胞激活和部分炎症因子的增多出现在大量运动神经元丢失之前。对ALS患者血清、皮肤及肌肉的分析结果显示机体存在广泛的炎症反应。这些证据提示炎症反应是ALS发病过程中的一个重要方面,可能介导了运动神经元的损伤。免疫炎症反应包括天然免疫应答和适应性免疫应答,其中天然免疫应答在神经变性疾病中的重要作用逐渐引起广泛关注。构成中枢神经系统（CNS）天然防御系统的主要成分包括小胶质细胞和星形胶质细胞,在很多神经变性疾病中被激活,释放一系列炎性递质和其它一些损伤反应因子。炎症反应具有双重作用,适当的炎症反应可以促进组织修复,然而,当炎症反应过度或长期持续存在时,则可能加重组织损伤。目前,有关炎症反应在ALS中的确切作用及其机制还存在很多亟待解决的问题,需要深入研究、探讨,为开发新的治疗策略提供理论依据。炎症过程可以参与氧自由基形成,产生氧化应激。在CNS氧自由基的一个重要来源是活化胶质细胞的呼吸爆发系统。在炎症过程中,呼吸爆发系统的功能酶—NADPH氧化酶发生激活,释放大量的超氧阴离子（O2?..）,并可进一步反应生成H2O2、HOCl、?OH等其它活性氧（ROS）以及过氧化亚硝酸盐（ONOO?）。另外,NADPH氧化酶来源的ROS可以调控与免疫炎症相关的基因表达,导致神经免疫炎性因子TNF-α等的产生。因此认为NADPH氧化酶在氧化应激和炎症反应中均发挥着关键作用,而这两者又参与了ALS运动神经元损伤的病理过程。由此推测,NADPH氧化酶有可能介导了对运动神经元的毒性作用。机体内的自由基除了ROS外,还有活性氮（RNS）,其中最重要的是一氧化氮（NO）。在炎症过程中,神经元和激活的胶质细胞中一氧化氮合酶（NOS）表达或活性增加,导致大量NO产生,并可与O2?.反应生成强氧化剂ONOO?。有关NOS和NO在ALS中的确切作用一直是人们争论的焦点和研究的热点。NO作为一种重要的信使分子,在机体内具有双重功能,既是生物体内多种生理过程所必需的,又参与了多种疾病的病理生理过程。基于NO的这种复杂作用,有必要探讨其在炎症介导的运动神经元损伤中的确切作用。脊髓器官型培养保留有完整的脊髓水平组织结构和细胞间突触联系,较单细胞培养更接近在体生理环境,且运动神经元能够稳定存活较长时间,为研究ALS等慢性疾病提供了重要的技术手段。脂多糖（LPS）通过Toll样受体,激活机体的天然免疫系统（在CNS主要是小胶质细胞和星形胶质细胞）,引起炎症反应。因此本研究应用LPS,利用器官型脊髓薄片培养技术建立了炎症介导的运动神经元损伤的体外模型,并以此模型为基础,深入探讨了运动神经元的损伤机制。课题研究分三部分:第一部分利用脊髓器官型培养,加入合适浓度的LPS,诱导炎症反应,建立运动神经元相对选择性受损的体外培养模型,并对运动神经元的易受损性进行了分析;第二部分以此模型为基础,利用RT-PCR、免疫印迹等方法,研究了NADPH氧化酶在其中的变化规律,并应用相应的抑制剂apocynin证实了NADPH氧化酶在LPS诱导的运动神经元损伤中的关键作用;第三部分利用分子生物学等技术,证实LPS干预后可引起该培养体系中诱导型NOS （iNOS）和神经型NOS （nNOS）活性增加、NO生成增多,进一步应用NOS选择性和非选择性抑制剂均未能有效对抗运动神经元损伤,提示在该模型体系中,NO可能并未对运动神经元损伤起着决定性作用。一、脂多糖诱导的脊髓前角运动神经元损伤及其易感性研究目的:利用脊髓器官型培养,观察LPS能否诱导该体系炎症反应的发生,寻找合适的剂量建立运动神经元相对选择性受损的体外培养模型,探讨运动神经元易感性的可能原因。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,进行干预。对照组为单纯培养液,LPS组加入不同浓度的LPS （1、10、30、60μg/ml）,应用SMI-32和calretinin免疫组化染色对培养后2、3、4周时的脊髓薄片腹角运动神经元和背角中间神经元进行计数,透射电镜观察超微结构变化,测定各时点培养液中乳酸脱氢酶（LDH）含量,利用RT-PCR技术观察LPS处理后肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（L-1β） mRNA表达水平。选取30μg/ml LPS处理2周作为进行药物干预实验的剂量和时间。脊髓片体外培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS （30μg/ml）、细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM （10μmol/L）加LPS （30μg/ml）,干预2周后用免疫组化方法显示运动神经元,计数各组运动神经元数量。结果:⑴正常对照组脊髓薄片在体外存活良好,运动神经元数目恒定,1μg/ml LPS组各时点运动神经元数量无显著变化（P>0.05）,10μg/ml LPS组运动神经元数量随时间延长而逐渐减少,处理3周后与对照组比较有显著性差异（P<0.05）,而30、60μg/ml LPS组分别在处理2周和1周后出现运动神经元数量的减少（P<0.05, P<0.01）。⑵1、10、30μg/ml LPS处理13周以及60μg/ml LPS处理2周内背角中间神经元数量与对照组相比无显著变化（P>0.05）,60μg/ml LPS处理3周后中间神经元数量开始减少（P<0.05）。⑶10μg/ml LPS处理3周后出现LDH含量增高（P<0.05）,而30、60μg/ml LPS组LDH在LPS处理2周后即开始增高,与对照组比较有显著性差异（P<0.05）。⑷透射电镜观察,对照组神经元和胶质细胞结构基本正常;30μg/ml LPS处理2周后,超微结构显示腹角运动神经元空泡变性,线粒体肿胀、嵴断裂,内质网和高尔基体扩张,脊髓背角中间神经元超微结构改变不明显,小胶质细胞体积明显增大,胞浆内出现大量的脂滴和膜性小体。⑸30、60μg/ml LPS处理1天后,TNF-αmRNA水平较对照组明显增高（P<0.05, P<0.01）;处理3天后,IL-1β表达水平也明显升高（P<0.01）。⑹脊髓薄片体外培养1周后,同时应用10μmol/L BAPTA-AM和30μg/ml LPS进行干预,与LPS组相比,运动神经元存活数量明显增加（P<0.01）,胞体形态规则,突起增多。结论:在体外脊髓器官型培养体系中加入LPS,可以诱导炎症反应,引起剂量和时间依赖性的运动神经元数量减少和培养液中乳酸脱氢酶含量增高。30μg/ml LPS作用2周后,可引起SMI-32阳性运动神经元减少,超微结构改变,而并不明显影响中间神经元的存活,与ALS的病理特点相一致,可用于制备ALS的脊髓器官型培养模型。运动神经元缺乏钙网膜蛋白表达,而细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM减轻运动神经元损伤,提示钙离子缓冲能力较低是其较易受损的原因之一。该模型的建立,为后续研究ALS的发病机制、探索新的治疗策略提供了实验基础。二、NADPH氧化酶参与脂多糖诱导的运动神经元损伤目的:利用LPS诱导的运动神经元相对选择性受损的脊髓器官型培养模型,研究NADPH氧化酶在其中的变化规律,并应用相应的抑制剂反证其作用,以期阐明炎症过程中运动神经元受损的关键机制,从而为开发新的治疗策略提供理论依据。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS （30μg/ml）、NADPH氧化酶抑制剂apocynin （0.5、1 mmol/L）加LPS （30μg/ml）,干预2周后,用SMI-32免疫组化染色对运动神经元进行鉴定、计数。利用RT-PCR、Western blot等方法,检测NADPH氧化酶亚基gp91phox和p47phox mRNA水平、蛋白含量的变化,并测定各组脊髓薄片组织中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量和培养液中LDH含量。结果:⑴30、60μg/ml LPS处理3天后,gp91phox mRNA表达水平呈增高趋势,与对照组相比,有显著差异（P<0.05）;30μg/ml LPS处理2周后,gp91phox mRNA水平较对照组明显增高（P<0.01）;p47phox在各时间点不同处理组间基因转录水平无显著变化（P>0.05）。⑵30μg/ml LPS组,胞膜蛋白p47phox含量较对照组明显增加（P<0.01）;0.5、1 mmol/L apocynin和30μg/ml LPS同时干预组,胞膜蛋白p47phox含量与LPS组相比明显减少（P<0.01）。⑶同时应用0.5、1 mmol/L apocynin和LPS组,运动神经元数量较LPS组明显增加（P<0.01）,胞体形态良好,突起较丰富。⑷30μg/ml LPS处理2周后培养液中LDH含量较对照组明显升高（P<0.05）,0.5、1 mmol/L apocynin和LPS同时干预组,LDH含量较LPS组明显降低（P<0.05）。⑸30μg/ml LPS处理2周后培养脊髓薄片组织中MDA含量较对照组明显增高（P<0.01）,0.5、1 mmol/L apocynin和LPS同时干预组,MDA含量较LPS组明显降低（P<0.05, P<0.01）。结论:器官型脊髓培养组织经LPS处理后,胞膜中p47phox含量明显增加,NADPH氧化酶活性增高。给予apocynin干预,可以抑制p47phox亚基从胞浆转位到胞膜,从而抑制NADPH氧化酶激活,进而产生保护运动神经元的作用,培养液中LDH含量和脊髓薄片组织中MDA含量也较LPS组明显下降,从不同角度证实了apocynin的有益作用。本研究证实了NADPH氧化酶在LPS诱导的炎症反应介导的运动神经元损伤中发挥着关键作用,为ALS的治疗提供新策略。三、一氧化氮在脂多糖诱导的脊髓前角运动神经元损伤中的作用目的:在脊髓器官型培养模型的基础上,观察LPS干预后iNOS和nNOS的表达情况、酶活力变化以及NO水平的改变,并应用NOS相应的选择性或非选择性抑制剂,探讨NO在炎症介导的运动神经元损伤中的确切作用。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切片进行体外培养,正常培养1周后,分别给予单纯培养液、LPS （30或60μg/ml）,处理3天或2周后,收集脊髓薄片组织,检测各组NOS mRNA水平和酶活性改变;并留取处理3天、1周、2周后培养液,测定NO含量变化。药物干预实验时LPS浓度选用30μg/ml,分为以下几组:对照组、LPS组、iNOS选择性抑制剂1400W或AG加LPS组、nNOS选择性抑制剂7-NI加LPS组、NOS非选择性抑制剂L-NAME加LPS组,测定干预后3天、1周、2周后培养液中NO含量,并应用SMI-32免疫组化染色对运动神经元进行鉴定、计数。结果:⑴30、60μg/ml LPS处理3天后,iNOS mRNA表达较对照组明显增强（P<0.01）,nNOS mRNA水平与对照组相比无明显变化（P>0.05）;30μg/ml LPS处理2周后,iNOS mRNA水平较对照组增加,差异有显著性（P<0.01）,nNOS mRNA水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。⑵30μg/ml LPS处理3天后,总NOS、iNOS、nNOS酶活性均明显升高,与对照组相比差异有显著性（P<0.01）;处理2周后,总NOS活力较对照组明显升高（P<0.05）。⑶正常对照组各时点培养液中NO含量很低,30μg/ml LPS处理3天或1周后,NO含量较对照组明显增高（P<0.01）,2周后NO含量与前相比有所降低,但仍高于对照组,差异有显著性（P<0.01）。⑷1400W或AG干预后,可明显抑制LPS引起的NO水平增高（P<0.01）,然而运动神经元数量与LPS组相比并无显著性差异（P>0.05）。⑸7-NI干预后培养液中NO含量较LPS组下降,差异有显著性（P<0.01）,但两组间运动神经元数量并无明显差异（P>0.05）。⑹L-NAME干预后,可明显抑制LPS引起的NO水平增高（P<0.01）,但运动神经元数量与LPS组相比并无显著性差异（P>0.05）。结论:LPS在脊髓器官型培养体系中可以诱导iNOS mRNA水平和酶活力升高、nNOS活性增加以及NO生成增多,但应用iNOS抑制剂1400W和AG、nNOS抑制剂7-NI、NOS非选择性抑制剂L-NAME均未证实NO在该培养体系中对介导运动神经元损伤具有关键作用,单纯抑制NO生成并不能明显改善运动神经元的存活。鉴于NO来源于三种不同的NOS及其自身作用的双重性,在疾病的不同阶段调控不同来源NO的生成量比单纯抑制NO生成将可能具有更好的治疗应用前景。
论文目录
相关论文文献
- [1].谷氨酸兴奋性毒性模型的研究[J]. 脑与神经疾病杂志 2013(02)
- [2].脂多糖对脊髓前角运动神经元的损伤作用[J]. 细胞生物学杂志 2008(01)