论文摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是研究作物产量、转基因、杂种优势、植物病虫害抗性和其它抗逆等方面的重要遗传材料，也是基础研究的模式植物之一。水稻的生长发育过程几乎都与蛋白激酶引起的信号转导过程有关，研究激酶尤其是其磷酸化过程和筛选其下游底物，了解植物发育调控机理尤其是抗逆机理，对农业生产具有重要的意义。本试验建立了一种基于Pooling系统的水稻蛋白质芯片的方法，每个样品接取10个水稻根cDNA库克隆，诱导表达后，用溶菌酶高通量地裂解提取蛋白质，总共提取了60板（96孔板）来自于水稻cDNA库表达的β-gal融合蛋白质，共6000个样品，大约涵盖60000个克隆；再把所提取的蛋白质进行10倍的Pooling，得到Pooling之后的蛋白质样品15板，所含样品数为1200个。应用Dot blotting的方法，检测了所有混合蛋白质的基本表达情况，另外表达了一板蛋白质，包括57个GST-水稻蛋白激酶和4个MBP-水稻蛋白质，将所有这76板蛋白质点在同一张芯片上。用Anti-β-gal和Anti-GST杂交芯片检测芯片质量，并利用该芯片对水稻蛋白激酶PI-D2进行了作用底物初步筛选的研究。结果如下：1.基于Pooling的方法，表达了大约60000个水稻根cDNA克隆的蛋白质。2.利用溶菌酶裂解的方法，方便地同时提取多个蛋白质，满足了构建水稻蛋白质库需大量提取蛋白质的需要。3.用Dot blotting方法检测了基于Pooling系统提取的水稻库混合蛋白质的表达情况，结果表明，蛋白质库质量的表达水平能够用来点制水稻蛋白芯片。4.制备了含有7271个蛋白质样品的水稻蛋白质芯片，并用Anti-β-gal和Anti-GST抗体对水稻蛋白质芯片进行质量检测，结果说明蛋白芯片质量较好。5.用该水稻蛋白质芯片，进行了水稻蛋白激酶PI-D2作用底物初步筛选的研究，获得了一些可能的候选底物。基于Pooling构建的水稻蛋白质芯片，减少了工作量，节约了成本和试剂用量。该芯片可能具有多种用途，如：研究蛋白质和蛋白质之间的相互作用、蛋白质和DNA之间的作用、蛋白质和脂类之间的作用、蛋白质和药物之间的作用等。其中用于水稻蛋白激酶底物的筛选为其中的典型应用，可以系统化的筛选激酶底物，从而对水稻信号转导过程有进一步的了解。