论文摘要
棉花是世界上重要的纤维作物,在世界经济中占有重要地位。棉纤维的产量和品质直接决定了棉花生产的产值和效益,利用基因工程手段来增加产量和改良品质是一种高效的途径,而有效的胚珠和纤维特异表达启动子是实现这一目标的关键部分。到目前为止,已获得的特异启动子数量非常有限,为找寻更多有效的纤维和胚珠特异表达启动子,本论文根据前人的研究选取了五个来源于拟南芥、烟草、菜豆的种子特异表达启动子,分别是BAN（BANYULS gene promoter）、AAP1（Amino acid permease gene 1 promoter）、AAP2（Amino acid permease gene 2promoter）、NtSC（Tobacco seed coat cryptic promoter）和PV（Seed storage proteingene arcelin 5-Ⅰpromoter）,将其与GUS报告基因连接并构建了植物表达载体,然后分别导入烟草（Nicotiana tabacum,Xanthin）和棉花冀棉14（Gossypium hirsutum,Jimianl4）,并用组织化学染色方法分析了它们的表达特性。主要结果如下:1.五个启动子在烟草中的表达特性转基因烟草的GUS染色分析表明,BAN和NtSC启动子驱动GUS基因特异地在烟草珠被（种皮）中强烈表达,而在种皮以外的器官或组织如种胚、花药、根、茎、叶、幼苗等未检测到GUS活性。从表达时期上看,在-2dpa（dayspost-anthesis）花蕾的胚珠中就开始有BAN启动子表达,直到种子发育成熟都一直检测到了GUS活性。NtSC启动子则在开花后的胚珠中表达,其表达持续至种子成熟。在烟草中,AAP1启动子在种皮和胚中特异表达,其它器官和组织没有检测到GUS活性。AAP1启动子在胚发育的早期即开始表达,随着胚的发育,表达强度逐渐减弱,到种子成熟时则检测不到GUS基因表达。PV启动子也特异地在烟草种子中表达,与AAP1启动子不同,PV仅在胚中表达而在种皮中没有GUS活性。从表达时期上看,PV启动子在种胚发育的各时期都有表达,并且表达强度高。在种子萌发而成的幼苗的子叶、胚轴、胚根中也检测到了GUS活性。AAP2启动子在烟草的根、茎的维管束和叶脉中都有表达,在胚珠中有微弱的GUS基因表达。这些结果表明,AAP2在烟草中是维管组织特异表达的启动子。2.四个特异启动子在棉花中的表达特性根据以上五个特异启动子在烟草中的表达特性,我们选取BAN、AAP2、AAP1和NtSC四个在种皮里有表达活性的启动子来进行棉花遗传转化,以研究它们在棉花中的表达模式。转基因棉花的GUS染色分析结果表明,BAN启动子主要在棉花胚珠、种皮、纤维、根的内皮层、茎的木质部和叶柄中表达。在-1dpa的胚珠中检测到GUS活性,表达持续到种子成熟,4～5dpa是表达最强时期。1dpa胚珠染色后切片观察表明,表达部位限定在种子的表皮及突起的纤维细胞中。在AAP1::GUS和NtSC::GUS转基因棉花中,GUS基因的表达组织部位相同,均特异地在种子胚中表达。从表达时期看,AAP1和NtSC启动子都在子叶胚时期开始表达,表达持续到种子成熟,在种子萌发后仍然能检测到GUS活性。从表达强度看,AAP1启动子开始表达时较强,随后逐渐减弱;NtSC启动子开始表达时较弱,种子成熟时表达较强。AAP2启动子在棉花的根和胚乳中特异表达。20dpa的棉花种子中,胚囊里的胚乳组织有GUS蓝色染出,随着胚的成熟染色越来越深,种子成熟时,在紧裹胚的胚乳遗迹上仍有强烈的GUS表达。在根中,GUS仅在维管组织的韧皮部中表达,其它部位未检测到GUS活性。本论文研究结果表明,PV、AAP1、AAP2和NtSC启动子在不同植物中表达特异性相似,BAN在棉花中的表达特性与烟草不同。这几个启动子在棉花中的表达均具有特异性,根据它们在棉花中的表达特性,这些研究结果可为这5个启动子在植物基因工程中的应用奠定基础,也为棉花基因工程研究提供了特异启动子。