具有天然生物活性的重组人HFRS抗体在转基因小鼠乳腺中的表达

论文题目: 具有天然生物活性的重组人HFRS抗体在转基因小鼠乳腺中的表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 于舒洋

导师: 李宁,梁米芳

关键词: 肾综合征出血热,汉坦病毒,转基因小鼠,人源重组抗体

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 肾综合征出血热(HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属汉坦病毒引起的一种急性病。血清学调查证实在五大洲都有汉坦病毒疫源地存在的证据。利用单克隆抗体治疗HFRS具有常规疗法无可比拟的优势。为获得乳腺高效表达人源重组抗体(rHMAbs)的小鼠模型,分别构建抗体基因轻链表达载体pBC1-hG2L和重链表达载体pBC1-hG2H,等比例混合利用显微注射方法共同注射受精卵雄原核制备转基因小鼠。在75只小鼠,用PCR和Southern杂交的方法检测出6(2♀,4♂)只为双链整合转基因阳性小鼠和6只仅整合重链的阳性小鼠,没有获得只整合轻链转基因阳性小鼠。转基因整合率16%,双链整合率为8%。将双链整合的阳性小鼠与野生型小鼠配种扩群。Western Blot检测转基因阳性母鼠的乳汁中rHMAbs的表达,在F0代鼠(F0-5)和F1代鼠(F1-6、F1-9、F1-20、F1-28、F1-38、F1-64)全部检测到重组人HFRS抗体的表达。ELISA进一步定量分析表明全部检测的双链整合母鼠乳汁中重组人HFRS抗体的表达量均在1mg/ml以上,表达量最高的F1-6号小鼠达到6.6mg/ml。免疫荧光试验(IFA)实验检测结果表明转基因小鼠乳中rHMAbs具有与HNTV和SEOV两个亚型的汉坦病毒特异结合的活性,微量荧光减少法中和实验检测结果表明rHMAbs可以在一定的滴度下在体外中和具有活力的病毒使之失去侵染细胞的能力。将乳中rHMAbs活力较高转基因鼠再次与野生型小鼠配种,采取被转基因鼠乳哺育的转基因鼠后代乳鼠(5日龄)血清,分析rHMAbs通过哺乳后是否能够进入小鼠体内及其对小鼠的保护作用。Western blot, ELISA检测转基因后代乳鼠血清结果表明rHMAbs可以被后代乳鼠吸收,但是分子量大小发生了改变。免疫荧光试验(IFA)和中和试验检测后代乳鼠血清中的rHMAbs,发现尽管rHMAbs受到了后代乳鼠自身的修饰,但其结合特异性与中和病毒的活性没有改变。这也间接证明了rHMAbs可以通过母婴免疫保护后代小鼠不受汉坦病毒的侵染。进一步对rHMAbs被后代乳鼠自身修饰后的分子量改变作了部分分析验证,结果表明rHMAbs重链没有发生显著的改变,而轻链不但受到N-linked糖基化修饰,而且还可能存在其它多种方式的修饰。本实验利用pBC1载体上的调控元件构建了分别含有肾综合征出血热轻、重链基因的转基因乳腺特异性表达载体并建立了能够遗传稳定的转基因鼠系。检测到rHMAbs在转基因小鼠乳中的高效表达(最高达到6.6mg/ml)。验证了转基因小鼠乳中rHMAbs具有完全的天然活性。为进一步制备转基因家畜奠定了基础,同时验证了rHMAbs通过哺乳可以对后代小鼠提供保护,并发现rHMAbs受到了小鼠自身的修饰而发生了分子量的变化,但仍然保持了天然活性,我们也由此推测是否内源的抗体通过乳鼠消化道后也会受到类似的修饰,如果此推论得到证实,那么这种生理机制的生物学意义将很值得进一步深入研究与探讨。

论文目录:

缩略表

技术路线图

第一章 文献综述

引言

1.1 汉坦病毒及其相关疾病研究进展

1.1.1 汉坦病毒(HV)的基因组及编码产物

1.1.2 汉坦病毒感染后诱导的免疫应答

1.1.3 汉坦病毒(HV)的分型

1.1.4 汉坦病毒(HV)的传播途径

1.1.5 汉坦病毒(HV)在全球的流行近况

1.1.6 HFRS和HPS临床表现

1.1.7 我国对HFRS防治策略

1.1.8 对HFRS的常规治疗原则和经验

1.1.9 汉坦病毒单克隆抗体的研制和应用

1.2 转基因动物研究进展

1.2.1 转基因动物的制作方法

1.2.2 转基因动物作为生物反应器独具优势

1.2.3 转基因动物研究的应用

1.3 转基因动物生产抗体

第二章 材料与方法

引言

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 实验结果

引言

3.1 表达载体的构建

3.1.1 HFRS糖蛋白G2抗体基因轻链和重链乳腺表达载体构建策略

3.1.2 表达载体的获得及鉴定

3.1.3 轻链表达载体加新霉素标记基因

3.2 转基因小鼠模型建立及相关检测

3.2.1 双基因共显微注射法生产转基因小鼠

3.2.2 转基因小鼠PCR检测

3.2.3 转基因小鼠传代

3.2.4 转基因小鼠的Southern blotting检测

3.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳检测转基因小鼠的乳中rHMAbs的表达

3.2.6 Western blot检测转基因小鼠的乳中rHMAbs的表达

3.2.7 ELISA确定rHMAbs的表达量

3.3 人重组抗体(rHMAbs)的活性检测

3.3.1 免疫荧光(IFA)法验证rHMAbs的结合特异性

3.3.2 微量荧光减少法体外中和实验检测rHMAbs中和病毒的能力

3.4 人重组抗体(rHMAbs)通过哺乳对后代小鼠保护的研究

3.4.1 检测rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的存在

3.4.2 分析rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的分子量变化

3.4.3 分析rHMAbs在转基因小鼠后代乳鼠血清中的活性

第四章 分析与讨论

引言

4.1 关于表达载体

4.1.1 转基因表达载体的调控元件分析

4.1.2 转基因表达载体的构建过程中的经验总结

4.2 关于转基因小鼠

4.2.1 双基因共注射获得转基因小鼠

4.2.2 外源基因在转基因小鼠基因组中的整合效率

4.2.3 转基因小鼠传代

4.2.4 rHMAbs在转基因小鼠乳中表达

4.3 转基因鼠乳中人重组抗体(rHMAbs)的活性

4.3.1 rHMAbs的结合特异性

4.3.2 rHMAbs的中和活性

4.3.3 rHMAbs对后代乳鼠的保护

4.4 重组抗体分子量变化的分析

第五章 结论

参考文献

致谢

附录：载体构建过程中的重要测序结果

个人简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

• [1].拉米夫定和干扰素α对孕期降低HBV转基因小鼠血中HBV载量有效性和安全性的初步研究[D]. 李端.第四军医大学2004
• [2].人ACE2转基因小鼠对SARS-CoV的易感性及SARS发病机制的实验研究[D]. 杨秀红.中国协和医科大学2007
• [3].乙型肝炎病毒感染模型的建立及其早期入侵的分子机制的研究[D]. 何文辉.北京协和医学院2013

相关论文

• [1].异种克隆牦牛，羚牛及相关机理的研究[D]. 李彦欣.中国农业大学2004
• [2].转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究[D]. 刘建忠.华中农业大学2000
• [3].拟蜘蛛牵丝蛋白基因在大肠杆菌和小鼠乳腺表达研究[D]. 许红韬.中国农业大学2004
• [4].发育相关基因在新生死亡体细胞克隆牛中的表达[D]. 李世杰.中国农业大学2004
• [5].利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D]. 张运海.中国农业大学2005
• [6].影响猪体细胞克隆胚胎发育能力的因素研究[D]. 潘登科.中国农业大学2005
• [7].猪腮腺分泌蛋白表达特性及表达调控元件的研究[D]. 田兴华.中国农业大学2005
• [8].猪转化生长因子β1基因多态性与猪产仔数关系的研究[D]. 武艳萍.中国农业大学2005
• [9].鸡类胰岛素生长因子-Ⅰ基因单碱基突变对该基因转录、表达以及对生长、屠体性状的影响[D]. 颜炳学.中国农业大学2005
• [10].利用DNA芯片对盐酸克伦特罗减少猪脂肪积累分子机制的初探[D]. 张瑾.中国农业大学2005

标签：肾综合征出血热论文;  汉坦病毒论文;  转基因小鼠论文;  人源重组抗体论文;