农村户用沼气池污泥中微生物多样性分析

论文摘要

沼气发酵生态系统的复杂性与独特性决定了其中微生物的多样性及基因资源的珍稀性,深入开展农村户用沼气池发酵微生物的研究将加快农村沼气工艺的发展进程。本论文系统开展了农村户用沼气池污泥微生物总DNA提取方法的研究；建立了农村户用沼气池污泥微生物16S rRNA基因V3区PCR-DGGE分析平台；开展了农村户用沼气池污泥样品中mcrA功能基因多样性研究。获得了如下主要研究结果与结论：首先,采用化学裂解法、溶菌酶裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit提取了沼气池污泥样品中微生物的总DNA,对三种方法的DNA得率、纯度、大片段提取效果以及是否含有PCR反应抑制剂进行了研究,最后对16S rRNA基因V3区的扩增产物进行了PCR变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）分析。与化学裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit法相比,溶菌酶裂解法得到的DNA量大,片段长,片段分布广,PCR扩增效率高；同时PCR-DGGE图谱显示,溶菌酶裂解法可更好地展示沼气池污泥中微生物的多样性。其次,通过对PCR-DGGE条件的优化,建立了农村户用沼气池污泥微生物16S rRNA基因V3区PCR-DGGE分析平台。通过PCR-DGGE技术分析了沼气池污泥中细菌和古菌微生物多样性随沼气池深度的变化规律,结果表明农村户用沼气池污泥中含有丰富的微生物资源,其中细菌群落受污泥深度因素影响小,而浅层污泥中古菌群落与深层污泥中古菌群落却存在明显差别。最后,通过构建污泥样品mcrA功能基因克隆文库,应用RFLP技术,开展了农村户用沼气池污泥样品中与次级代谢产物相关的功能基因多样性研究。结果表明,所采集的沼气池污泥中含有较为丰富的产甲烷菌资源,但其中也可能存在类似功能或产生类似代谢物质的产甲烷菌。本论文的意义与主要创新点是：建立了农村户用沼气池污泥微生物多样性分析平台,并初步分析了农村户用沼气池微生物多样性,不仅为进一步优化沼气发酵微生物群落结构、筛选功能基因提供了科学依据,而且为实现高效、可控的农村沼气发酵工艺奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 农村户用沼气池污泥微生物研究现状与必要性
• 1.1.1 我国农村秸秆能源消费现状
• 1.1.2 农村户用沼气池污泥生境的特点
• 1.1.3 沼气发酵微生物的研究进展
• 1.1.4 农村户用沼气池污泥微生物资源的开发应用前景
• 1.2 环境微生物分子生态学研究方法及进展
• 1.2.1 传统生态学研究方法
• 1.2.2 分子生态学研究方法
• 1.2.3 分子生物学技术在沼气池微生物生态研究中的地位与作用
• 1.3 研究目的、意义及主要研究内容
• 1.3.1 目的与意义
• 1.3.2 主要研究内容
• 第二章 农村户用沼气池污泥中微生物DNA的提取方法
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 沼气池污泥微生物总DNA的提取
• 2.1.3 DNA纯度及得率的统计学比较
• 2.1.4 脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Electrophoresis,PFGE）检测DNA分子大小
• 2.1.5 PCR扩增效应的比较
• 2.1.6 16S rRNA基因V3区变性梯度凝胶电泳图谱的比较
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 三种提取方法DNA纯度及得率的统计学比较
• 2.2.2 三种提取方法PCR效应的比较
• 2.2.3 三种提取方法DNA大小的比较
• 2.2.4 DGGE平台的建立
• 2.2.5 三种方法所提DNA的16S rRNA基因V3区DGGE图谱的比较
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 农村户用沼气池污泥中微生物群落结构调查
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 溶菌酶裂解法提取沼气池污泥微生物总DNA
• 3.1.3 脉冲场凝胶电泳分析
• 3.1.4 16S rRNA基因V3区变性梯度凝胶电泳分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 沼气池污泥微生物总DNA随污泥深度的变化规律
• 3.2.2 沼气池污泥中细菌及古菌多样性随污泥深度的变化规律
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 沼气池污泥中微生物次级代谢产物合成的相关基因（mcrA）多样性的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 溶菌酶裂解法提取沼气池污泥微生物总DNA
• 4.1.3 产甲烷菌mcrA片段的扩增
• 4.1.4 PCR产物的纯化与定量
• 4.1.5 连接
• 4.1.6 感受态细胞的制备
• 4.1.7 转化
• 4.1.8 鉴定
• 4.1.9 RFLP分析
• 4.1.10 mcrA序列测定与系统进化关系的分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 沼气池污泥总DNA的提取
• 4.2.2 mcrA基因的多样性分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢