离子束介导甘草基因组DNA转化酵母菌的研究

论文摘要

甘草是一种重要的药用植物,甘草酸（GA）又名甘草皂苷、甘草甜素,是甘草地下部分最重要的五环三萜皂苷类生理活性物质之一,其生物合成由多基因控制,在目前还不完全了解其遗传背景的情况下,尚无法构建目的基因的质粒载体。因此进行甘草基因组DNA的遗传转化具有重要的理论和实践意义。本研究在前期研究的基础上采用剂量为15×1015 ions/cm2的N+和Ar+分别注入介导甘草基因组DNA转化酵母菌,获得了1266株T2代重组酵母菌,其中N+注入介导获得772株,Ar+注入介导获得494株。以黄酮类和皂苷类物质为目标产物进行定性检识,结果表明应用N+注入介导甘草基因组DNA转化酵母菌时,其转化率低于Ar+注入介导,但其对T3代的遗传稳定性高于后者。这意味着具有生物活性的N+注入介导甘草基因组DNA转化酵母菌,其质量沉积作用对重组酵母菌的遗传稳定性具有一定的促进作用。对黄酮类和皂苷类物质定性检识为阳性反应的重组酵母菌T4T8代菌株培养液进行了薄层层析色谱实验,获得了遗传稳定的产甘草酸和（或）甘草次酸的重组菌株12株,同时获得了遗传稳定的产甘草黄酮类物质的重组菌株2株,以及产新的红色组分的重组菌株2株。RP-HPLC检测结果表明,遗传稳定的重组菌株的甘草酸（GA）最高产量达到114.49mg/L,18-α和18-β甘草次酸（GAs）最高产量分别为0.56mg/L和0.81mg/L。本研究获得的重组菌株,为研究GA生物合成的关键功能基因及其调控提供了宝贵材料,也为微生物发酵生产GA提供了理论和实践依据,将对干旱半干旱荒漠区药用植物基因组学的研究、生态环境的保护和中药现代化产生深远影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 离子注入生物学
• 1.1.1 离子注入的特点
• 1.1.2 离子注入的生物学效应
• 1.1.3 离子注入在生物学理论研究与实践中的主要应用
• 1.1.4 离子注入介导外源DNA 的遗传转化
• 1.2 药用植物甘草
• 1.2.1 甘草的资源分布
• 1.2.2 甘草中的化学成分
• 1.2.3 甘草的药理作用
• 第二章 基本理论
• 2.1 黄酮类化合物的理化性质及显色反映
• 2.1.1 结构
• 2.1.2 性状
• 2.1.3 溶解性
• 2.1.4 酸性与碱性
• 2.1.5 显色反映
• 2.2 甘草皂苷的结构特点及性质
• 2.2.1 皂苷的结构特点
• 2.2.2 甘草皂苷的结构
• 2.3 层析分离方法简介
• 2.3.1 荧光薄层
• 2.3.2 络合薄层
• 2.3.3 酸碱薄层和PH 缓冲薄层
• 2.3.4 应用
• 第三章 研究内容
• 3.1 研究目的及意义
• 3.2 工作及创新性
• 第四章 材料与方法
• 4.1 仪器设备
• 4.2 菌种
• 4.3 培养基
• 4.4 保护液的组成及制备
• 4.5 其他材料
• 4.6 基本方法
• 4.6.1 离子注入前的准备工作
• 4.6.2 制膜
• 4.6.3 离子注入
• 4.6.4 洗脱与培养
• 4.6.5 液体培养
• 4.6.6 离心
• 4.6.7 黄酮类物质的定性检识
• 4.6.8 皂苷类物质的定性检识
• 4.6.9 遗传稳定性试验
• 4.6.10 薄层层析
• 4.6.11 高压液相测试
• 第五章 结果与分析
• 5.1 技术路线
• 5.2 实验结果与分析
• 5.2.1 重组酵母菌培养液中皂苷和黄酮类物质的定性检识
• 5.2.2 重组酵母菌培养液的薄层层析色谱
• 5.2.3 重组酵母菌遗传稳定性
• 5.2.4 重组酵母菌培养液的 RP-HPLC
• 第六章 结论与建议
• 参考文献
• 在读期间发表论文清单
• 致谢