猪IgG Fc受体及其介导PRRSV抗体依赖增强作用研究

论文摘要

Fc受体（FcR）为特异亲和免疫球蛋白（Ig） Fc片段的细胞表面分子,广泛表达于免疫细胞表面,具有许多重要的生理功能,是体液免疫与细胞免疫的联系纽带,在机体免疫调控中起关键作用。目前人和小鼠的三类IgG Fc受体（FcγRI、FcγRII和FcγIII）研究最为深入。本研究克隆和鉴定了猪IgG三类Fc受体;研究了PRRSV变异毒株和经典毒株感染后活化性Fc受体和抑制性Fc受体的转录动态差异及与免疫抑制的关系;构建了稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系,研究了该受体在介导PRRSV ADE中的重要作用。用人CD64氨基酸序列检索NCBI的EST数据库（包括除人和老鼠以外的所有物种核苷酸序列）（tBLASTn）,发现了6个猪的高同源overlapping序列,利用这些序列信息设计引物,采用RT-PCR从猪外周血白细胞中扩增到了猪FcγRI cDNA序列,命名为poFcγRI。poFcγRI ORF全长1038 bp,编码346氨基酸的糖蛋白。胞外区包括三个Ig样结构,有4个N-糖基化位点。poFcγRI和人、牛与老鼠的FcγRI在氨基酸水平上分别有79%、69%和57%的相似性。胞外环区相似性较高,分别为77%、74%和70%,这提示人、牛、猪、鼠的FcγRI和IgG的结合域高度保守。随后,RT-PCR检测到了poFcγRI mRNA在巨噬细胞、单核细胞中表达量较高,在多形核细胞中也有表达,在淋巴细胞中没有表达,和人与小鼠CD64的表达谱类似。将poFcγRI ORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA构建成重组质粒pcDNA/poFcγRI,再用脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环实验鉴定了poFcγRI配体亲和特性。对猪IgG Fc受体的进一步研究发现猪IgG Fc受体共由三类分子组成,即FcγRI、FcγRII和FcγIII,克隆了这三类受体cDNA,其中FcγRII胞内区有保守的ITIM基序,为抑制性受体;FcγRI和FcγRIII胞内区没有发现已知的信号传导基序,通过γ链的ITAM基序进行信号转导,因而这两个受体为活化性受体。发现FcγRII至少存在两个亚类,即FcγRIIB1和FcγRIIB2,FcγRIIB1胞内区有一插入序列,使胞内区由47个氨基酸延长到99个氨基酸。这两个亚类胞内区均存在ITIM基序,因此均为抑制性受体。活化型受体和抑制型受体共表达于免疫细胞表面,共同调节抗体对免疫细胞的活化作用。抗原抗体复合物和免疫细胞表面的活化型受体给合,能活化免疫效应细胞,诱发多种免疫学效应。抑制型受体的作用刚好相反,通过免疫复合物与抑制型受体交联,抑制活化受体介导的细胞活化。研究PRRSV感染后活化型和抑制型Fc受体的转录动态,对于揭示PRRSV感染引起的免疫抑制有重要意义。通过Real-time PCR检测不同毒株PRRSV感染后猪体活化性和抑制性Fc受体的转录动态,发现PRRSV感染后活化性受体FcγRI和FcγRIII均迅速下调,而抑制性Fc受体FcγRII感染后有轻微上调。PRRSV感染后机体能够快速诱导产生高水平的特异性抗体,但感染后活化性Fc受体下调导致抗体和抗原抗体复合物不能活化免疫效应细胞,从而引起细胞免疫功能下降,这是PRRSV感染引起免疫抑制的分子基础。抗体依赖增强作用（ADE）是PRRS防控中遇到的最大的难题之一。本研究将猪FcγRII基因转染Marc-145细胞,通过G418连续筛选和克隆获得了稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系。用PRRSV BJ-4株与1:320稀释的抗PRRSV IgG感染克隆化的Marc-145细胞系,在有抗体存在的情况下PRRSV感染收获的病毒量明显高于对照组,证明了poFcγRII能够介导PRRSV ADE作用。在PRRSV免疫效果评价当中,现有的评价标准是测定疫苗免疫后的PRRSV特异性抗体。但ADE作用的存在使PRRSV特异抗体在特定情况下不仅没有保护作用,反而有助于感染。本研究构建的稳定表达猪FcγRII的Marc-145细胞系能够方便的评价抗体的ADE作用,从而为研制高效PRRSV疫苗提供技术支持。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1 IgG Fc 受体

2 Fc 受体的命名、分类

3 IgG Fc 受体的基本生物学特性及家畜IgG Fc 受体研究进展

3.1 FcγRI （CD64）

3.2 FcγRII （CD32）

3.3 FcγRIII （CD16）

3.4 boFcγ2R

3.5 moFcγRIV

4 FcγR 的免疫学功能研究进展

4.1 调节抗体介导的免疫细胞活化

4.2 介导抗体亚类的不同免疫功能

4.3 介导细胞吞噬作用

4.4 介导ADCC 作用

4.5 介导树突状细胞抗原提呈

5 PRRSV 免疫学研究进展

5.1 PRRSV

5.2 PRRSV 体液免疫研究进展

5.3 PRRSV 细胞免疫研究进展

5.4 PRRSV 免疫调节和免疫逃逸研究进展

5.5 PRRSV 毒力变异与分子遗传标记研究进展

5.6 PRRSV 遗传多样性和疫苗研究进展

6 抗体依赖增强作用（ADE）研究进展

7 PRRSV 存在ADE 作用

8 本研究的意义

第二章猪IgG Fc 受体基因克隆、鉴定

1 前言

2 材料

2.1 菌种、质粒、酶

2.2 细胞

2.3 试剂配制

2.4 试验动物

2.5 主要试剂盒

3 方法

3.1 poFcγRI cDNA 克隆

3.2 poFcγRI 在COS-7 细胞表面的表达

3.3 RT-PCR 检测poFcγRI 在猪免疫细胞中的表达分布

3.4 poFcγRII 基因克隆及变异分析

3.5 poFcγRIII 基因克隆及重组表达质粒的构建

3.6 序列分析

4 结果

4.1 poFcγRI cDNA 克隆

4.1.1 poFcγRI EST 检索

4.1.2 PCR 扩增poFcγRI

4.1.3 重组质粒 T-SR1 的酶切及 PCR 鉴定

4.1.4 poFcγRI cDNA 序列

4.2 poFcγRI 在COS-7 细胞表面的表达

4.3 poFcγRI mRNA 在猪免疫细胞中的转录

4.4 poFcγRII 基因克隆及变异分析

4.5 poFcγRIII 基因克隆及重组真核表达质粒的构建

5 讨论

5.1 猪IgG Fc 受体克隆策略

5.2 poFcγRI 序列分析

5.3 poFcγRI 在COS-7 细胞表面的表达

5.4 poFcγRI mRNA 在猪免疫细胞中的转录

5.5 poFcγRII 存在两个亚类

5.6 poFcγRIII 序列分析

5.7 FcγRs cDNA 进化分析

第三章 PRRSV 感染后FcγRs mRNA 转录与免疫抑制

1 前言

2 材料

2.1 病毒和细胞

2.2 主要试剂

2.3 试验动物及分组

3 方法

3.1 试验动物感染

3.2 外周血免疫细胞检测

3.3 体温检测及剖检

3.4 PRRSV 特异抗体检测

3.5 FcγRs Real-time PCR 检测

4 结果

4.1 不同毒株PRRSV 感染后猪外周血免疫细胞含量

4.2 血清抗体水平检测结果

4.3 体温变化、症状及病理变化

4.4 不同毒株PRRSV 感染后猪外周血白细胞FcγRs 转录

5 讨论

5.1 PRRSV 变异株HN07-01 引起高热

5.2 PRRSV 感染与免疫抑制

5.3 PRRSV 免疫抑制与活化性Fc 受体转录下调

第四章 poFcγRII 介导PRRSV 抗体依赖增强作用（ADE）

1 前言

2 材料

2.1 病毒和细胞

2.2 菌种、质粒、酶

2.3 主要试剂盒

3 方法

3.1 表达猪FcγRII 的Marc-145 细胞系建立

3.2 猪FcγRII 介导PRRSV 抗体依赖增强作用（ADE）

3.3 猪FcγRII 重组蛋白的制备

3.4 猪FcγRII 重组蛋白活性鉴定

3.5 兔抗猪FcγRII 多抗的制备

3.6 rsFcγRII 抗体对转染FcγRII Marc-145 细胞系介导PRRSV ADE 的阻断

3.7 数据分析

4 结果

4.1 poFcγRII 重组真核表达质粒的构建

4.2 表达猪FcγRII 的Marc-145 细胞系建立

4.3 poFcγRII 介异PRRSV ADE 作用

4.4 猪FcγRII 重组蛋白的制备

4.5 流式细胞测定rspoRII 阻断猪IgG 与Marc-145 细胞的poFcγRII 结合

4.6 兔抗猪FcγRII 多抗的制备

4.7 抗rsFcγRII 多抗对PRRSV ADE 的阻断作用

5 讨论

研究总结

参考文献

附录A：英文缩略词表

附录B：博士在读期间投稿和已发表的论文

猪IgG Fc受体及其介导PRRSV抗体依赖增强作用研究

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