麻疯树的抗冷性和SAD基因的克隆及表达研究

论文摘要

麻疯树（Jatropha curcas L）是一种大戟科（Euphorbiaceae）的油料植物，广泛分布于世界的热带亚热带地区，在我国的云南、四川、贵州等地也有大量生长，具有较大的开发应用潜力。但是，由于麻疯树耐热喜光而只在热带亚热带分布，这就限制了麻疯树的开发利用。植物的硬脂酰-酰基载体蛋白（ACP）脱饱和酶（SAD，EC.1.14.99.6）是脂肪酸合成代谢的关键酶，催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP。控制着植物体内膜脂和贮脂的饱和脂肪酸／不饱和脂肪酸的比例，和植物的抗寒性、抗病性等功能有密切关系。研究表明，膜脂不饱和脂肪酸含量高的植物抗冷性强。这里我们首先研究了麻疯树的抗冷性，为培育和筛选出耐冷性的麻疯树品种奠定基础。然后克隆了麻疯树的SAD基因，并对其进行了原核表达，以研究其功能。为利用基因工程技术，调节SAD基因活性，从而改善和SAD有关的植物功能（如抗冷性等）打下基础。 1、低温对麻疯树生理指标的影响 将麻疯树种子在正常条件下萌发，待长成幼苗后，用不同的低温（25℃、12℃、8℃、4℃），分别在不同时间内(1d、2d、3d、

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• 第一部分 麻疯树的抗冷性研究
• 第一章 低温对和麻疯树抗冷性有关的生理指标的影响
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 种子的萌发及幼苗培养
• 2.2.2 冷胁迫处理
• 2.2.3 生理指标测定
• 2.2.4 数据处理及分析
• 3.结果与分析
• 3.1 随时间的延长,各胁迫温度对麻疯树幼苗的影响
• 3.1.1 随处理时间延长,各胁迫温度对麻疯树幼苗叶绿素的影响
• 3.1.2 随处理时间延长,各胁迫温度对麻疯树幼苗根系脱氢酶的影响
• 3.1.3 随处理时间延长,各胁迫温度对麻疯树幼苗外渗电导率的影响
• 3.1.4 随处理时间延长,各胁迫温度对麻疯树不饱和脂肪酸的影响
• 3.2 随处理温度的降低,不同胁迫时间对麻疯树幼苗的影响
• 3.2.1 随处理温度降低,各胁迫时间对麻疯树幼苗叶绿素的影响
• 3.2.2 随处理温度降低,各胁迫时间对麻疯树幼苗根系脱氢酶的影响
• 3.2.3 随处理温度降低,各胁迫时间对麻疯树幼苗外渗电导率的影响
• 3.2.4 随处理温度降低,胁迫时间对麻疯树幼苗不饱和脂肪酸的影响
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二章 不同产地麻疯树的抗冷性研究
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 种子的萌发及幼苗培养
• 2.2.2 冷胁迫处理
• 2.2.3 生理指标测定
• 2.2.4 数据处理及分析
• 3.结果与分析
• 3.1 低温胁迫对麻疯树幼苗叶绿素的影响
• 3.2 低温胁迫对麻疯树幼苗根系活力的影响
• 3.3 低温胁迫对麻疯树幼苗外渗电导率的影响
• 3.4 低温胁迫对麻疯树幼苗膜脂不饱和脂肪酸的影响
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 麻疯树硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因的克隆及表达
• 第三章 硬脂酸-酰基载体蛋白脱饱和酶基因克隆
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌珠和载体
• 2.1.3 试剂盒、酶及药品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 简并引物设计
• 2.2.2 麻疯树SAD基因中游片段的克隆
• 2.2.3 3’-RACE（cDNA的末端快速扩增）扩增JSAD基因的下游片段
• 2.2.4 5’-RACE扩增JSAD基因的上游片段
• 2.2.5 JSAD全长cDNA序列的获得
• 2.2.6 PCR扩增片段的同收、连接
• 2.2.7 PCR扩增片段的转化和鉴定
• 2.2.8 测序和生物信息学分析
• 2.2.9 Southern杂交
• 2.2.10 Northern杂交
• 3.结果和讨论
• 3.1 JSAD cDNA的克隆
• 3.1.1 中游片段的获得
• 3.1.2 下游片段的获得
• 3.1.3 上游片段的获得
• 3.1.4 全长cDNA的获得
• 3.2 JSAD cDNA的序列分析
• 3.2.1 编码区的序列分析
• 3.2.2 3’-非翻译区的序列分析
• 3.3 推测的氨基酸的序列分析
• 3.3.1 推测的氨基酸
• 3.3.2 同源性分析
• 3.3.3 JSAD的保守性分析
• 3.3.4 JSAD的疏水区预测
• 3.3.5 蛋白质的修饰位点预测
• 3.3.6 蛋白质空间结构预测
• 3.3.7 Southern blot分析
• 3.3.8 Northern blot分析
• 小结
• 参考文献
• 第四章 麻疯树SAD基因在大肠杆菌中的表达
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料、菌株及质粒载体
• 2.1.2 试剂、试剂盒、酶
• 2.1.3 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 原核表达载体的构建
• 2.2.2 诱导表达
• 2.2.3 酶活性分析
• 3.结果和分析
• 3.1 表达载体的构建
• 3.2 PSM诱导表达条件的优化
• 3.2.1 诱导温度的优化
• 3.2.2 诱导时间的优化
• 3.2.3 IPTG的诱导浓度的优化
• 3.2.4 酶活性分析
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 文献综述
• 第五章 文献综述：植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶
• 摘要
• 1.SAD的研究过程
• 2.SAD的结构
• 3.SAD和其它相关蛋白
• 4.SAD的分子生物学研究
• 5.SAD的功能研究
• 5.1 响应低温变化
• 5.2 参与防御和生长调控过程
• 5.3 维持膜的生理状态并参与膜的形成
• 6.结束语
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文