论文摘要
最近研究发现,Wnt5a是一个高度特异的自分泌及旁分泌的巨噬细胞来源的效应分子,参与了炎症反应过程。Wnt5a释放到细胞外,成为一种重要的细胞因子,介导局部或全身炎症反应,成为目前感染及危重病防治研究的又一个重要分子靶点。热休克蛋白是热休克反应诱导产生的一类蛋白质,其中的诱导型热休克蛋白70（HSP70）是最重要的成员,也是诱导产生最多的成员。本研究先观察Wnt5a在烧伤感染病人血清中含量的改变,并探讨诱导型HSP70对Wnt5a表达、释放及促炎功能的影响。首先,本研究观察了Wnt5a在烧伤病人血清中的改变。结果如下:（1）烧伤病人血清中Wnt5a的含量显著高于正常对照组。动态观察发现,病情好转血清中Wnt5a含量降低,而病情恶化血清中Wnt5a持续升高;（2）烧伤病人血清中HSP70含量高于正常对照组,但病人的严重程度与血清中HSP70含量的变化关系不大。以上结果表明,Wnt5a,参与了烧伤病人炎症的发病过程,且检测Wnt5a可作为炎症严重程度的诊断指标。炎症因子主要是由微生物或微生物组份刺激单核巨噬细胞产生的,其中LPS诱导巨噬细胞产生与释放炎症因子是一个广泛采用的模型。本研究随后探讨了内毒素（LPS）及促炎因子TNF-α对Wnt5a表达释放的影响。研究发现,LPS能诱导巨噬细胞RAW264.7中Wnt5a表达上调及向胞外释放,同时能诱导促炎因子TNF-α的释放;用Wnt5a刺激巨噬细胞,能诱导TNF-α释放的显著提高;用TNF-α刺激巨噬细胞同样能诱导Wnt5a的表达释放上调。这与文献报道一致,促炎因子能促进Wnt5a的表达释放,Wnt5a又能促进其他炎症因子的表达释放。因此,本研究进一步证明Wnt5a是一个新的炎症因子,可能参与了烧伤病人炎症的发生发展过程。文献报道,抑炎因子白细胞介素（IL）-10与活化蛋白C（APC）能抑制Wnt5a的表达而抑制炎症反应,因此认为Wnt5a可以作为炎症治疗的新靶点。热休克反应（HSR）和HSP70在炎症中的作用也有一些研究。有人认为HSP70能抑制某些炎症因子的释放和表达,也有人认为,HSP70可能具有促炎功能。作为一个新发现的炎症介质,Wnt5a在炎症中功能还知道的很少。HSR和HSP70对Wnt5a的影响也都不清楚。热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是一高度保守的应激蛋白家族,广泛存在于原核细胞和真核细胞中。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的成员,其基本功能是参与新生蛋白质的折叠、解聚、移位等,故有“分子伴侣”（molecular chaperone）之称。长期以来,热休克蛋白被认为是细胞内的蛋白质,只能在细胞内发挥功能。为了观察细胞内的HSP70对Wnt5a的表达与释放的影响,在证明Wnt5a能为LPS诱导表达与释放,且Wnt5a又能刺激巨噬细胞释放其它炎症因子的基础上,本研究首次观察了HSP70对Wnt5a表达与释放及其促炎功能的影响。本研究首先构建了HSP70的表达载体。将HSP70的真核表达质粒导入巨噬细胞得到了高效表达。利用热休克预处理与转基因技术,分别探讨高表达HSP70的细胞受LPS或其他炎症因子刺激时释放Wnt5a的改变。结果发现,与未处理的细胞相比,温和的热休克（42℃）预处理后的细胞,在受到LPS与TNF-α刺激时候,（1）细胞内表达的Wnt5a降低;（2）向细胞外释放的Wnt5a减少。受LPS刺激后,转HSP70基因的细胞与转空载体的细胞相比,（1）细胞内表达的Wnt5a下降;（2）细胞向胞外分泌的Wnt5a减少。当用TNF-α代替LPS刺激细胞重复上述实验,得到类似结果。本研究同样观察了细胞内HSP70的上升对Wnt5a促炎功能的影响,发现不管是温和热休克（42℃）还是转HSP70基因,均能显著抑制Wnt5a诱导的TNF-α释放。上述结果表明,巨噬细胞内HSP70的表达上调既能显著抑制炎性刺激导致的Wnt5a的表达与释放,又能显著抑制Wnt5a的促炎功能。近年研究发现,HSP70能被释放到细胞外环境中,称为细胞外HSP70（extracellular HSP70）,而且细胞外HSP70可能作为免疫系统的“危险信号”,调节免疫细胞的功能,参与免疫性疾病的病理过程。近年来研究发现,脓毒症病人血中HSP70水平明显升高。为了进一步探讨细胞外（包括血清中）HSP70对Wnt5a的影响,本研究采用重组人HSP70刺激巨噬细胞,然后观察其对Wnt5a释放的影响。结果显示,HSP70本身对Wnt5a的释放没有显著影响,但能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞Wnt5a的释放。本研究同时检测了巨噬细胞IL-10的释放,表明细胞外HSP70能显著促进IL-10向细胞外释放。随后本研究观察了TLR2与TLR4在巨噬细胞抗炎因子IL-10分泌中的作用,发现IL-10的分泌依赖于TLR4。综上所述,烧伤患者血清中Wnt5a及HSP70水平均明显升高,并且血清中Wnt5a含量的高低与烧伤脓毒症的严重程度有关;LPS与TNF-α能促进巨噬细胞Wnt5a的表达上调与分泌上升,Wnt5a反过来又能刺激巨噬细胞释放TNF-α;热休克及转基因均能显著上调巨噬细胞内HSP70的表达,细胞内HSP70表达的上升既能抑制LPS及TNF-α诱导的Wnt5a的表达与释放,又能抑制Wnt5a诱导的TNF-α的释放;采用重组纯化的HSP70处理巨噬细胞同样能抑制LPS诱导的Wnt5a的释放,同时通过TLR4促进抑炎细胞因子IL-10的释放。因此,HSP70可能成为防治脓毒症的潜在药物。