本文主要研究内容
作者夏媛媛（2019）在《亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究》一文中研究指出：腈水合酶（Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84）能够催化腈在常温中性条件下与水化合形成酰胺,是替代高温强酸催化工艺实现酰胺类大宗化学品绿色制造的关键酶种。常见NHase是含?和?亚基的金属酶,酶的成熟遵循亚基自身交换机制。但酶的热稳定性和有机溶剂耐受性较差,难以满足工业化生产对酶学性质的应用要求。因此,亟需发掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依据新发现的领鞭毛虫（Monosiga brevicollis）单肽链腈水合酶的蛋白结构特点,对恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668）腈水合酶进行亚基融合重构,大幅提高腈水合酶的热稳定性和产物耐受性;又研究了来源于P.putida 5B和玫瑰色红球菌（Rhodococcus rhodochrous J1）的腈水合酶亚基融合突变体的活化机理,揭示了调控蛋白对于融合型腈水合酶的激活机制。主要研究结果如下:（1）对P.putida 5B来源的腈水合酶PpNHase进行亚基融合重构,获得了活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis单链腈水合酶的蛋白结构特点,采用亚基融合策略对PpNHase进行改造,获得了两种活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。其中共表达调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BA）P14K的比酶活比PpNHase提高了54%,而融合了调控蛋白的融合型腈水合酶NHase-（BAP14K）的比酶活较PpNHase提高了39%,两者在50°C的半衰期分别为PpNHase的2.8倍和2倍,对烟酰胺的产物耐受性也较PpNHase有一定的提高。（2）基于半理性改造,进一步提高腈水合酶的稳定性。以NHase-（BA）P14K为出发蛋白,通过结合点突变扫描程序和分子动力学模拟手段,建立了一个高效的小型突变库,并从中筛选出三个酶活和稳定性均提高的突变体B-M150C、B-T173Y和B-S189E,其催化效率较出发蛋白提高了1.1倍、1.5倍和2.2倍,在50°C的半衰期分别较出发蛋白提高了32%、7%及107%。（3）解析了融合型腈水合酶的成熟活化机理。通过优化表达策略,获得了来源于P.putida 5B和R.rhodochrous J1的腈水合酶调控蛋白P14K及NhlE。在此基础上对腈水合酶激活机制进行了探究。用单独的调控蛋白在体外与同源的不含钴的融合型腈水合酶进行混合后,获得了活化的成熟酶;此外,用调控蛋白激活不同来源的腈水合酶,也可以实现部分激活。本结果表明,调控蛋白起着类似金属伴随子的作用,协助输送钴离子到腈水合酶中;另外,调控蛋白不仅可以激活同源腈水合酶,也能激活异源腈水合酶,但对于自身来源的腈水合酶有着更高的激活效率。（4）成功表达M.brevicollis来源的单链腈水合酶Mb NHase。以大肠杆菌作为表达宿主对Mb NHase进行了可溶性表达,并测定了其比酶活为88.4 U·mg-1。根据调控蛋白可以激活异源腈水合酶的结论,构建了MbNHase与两种调控蛋白P14K、NhlE共表达的质粒,表达纯化后酶活测定发现,比酶活分别为220.2 U·mg-1和127.0 U·mg-1,是MbNHase的2.5和1.4倍。结果表明,两种细菌来源的调控蛋白可以协助真核来源的天然融合型腈水合酶提高活性。
Abstract
jing shui ge mei （Nitrile hydratase,jian chen NHase;EC:4.2.1.84）neng gou cui hua jing zai chang wen zhong xing tiao jian xia yu shui hua ge xing cheng xian an ,shi ti dai gao wen jiang suan cui hua gong yi shi xian xian an lei da zong hua xue pin lu se zhi zao de guan jian mei chong 。chang jian NHaseshi han ?he ?ya ji de jin shu mei ,mei de cheng shou zun xun ya ji zi shen jiao huan ji zhi 。dan mei de re wen ding xing he you ji rong ji nai shou xing jiao cha ,nan yi man zu gong ye hua sheng chan dui mei xue xing zhi de ying yong yao qiu 。yin ci ,ji xu fa jue xin xing NHase,gai liang mei de cui hua xing neng 。ben yan jiu yi ju xin fa xian de ling bian mao chong （Monosiga brevicollis）chan tai lian jing shui ge mei de dan bai jie gou te dian ,dui e chou jia chan bao jun （Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668）jing shui ge mei jin hang ya ji rong ge chong gou ,da fu di gao jing shui ge mei de re wen ding xing he chan wu nai shou xing ;you yan jiu le lai yuan yu P.putida 5Bhe mei gui se gong qiu jun （Rhodococcus rhodochrous J1）de jing shui ge mei ya ji rong ge tu bian ti de huo hua ji li ,jie shi le diao kong dan bai dui yu rong ge xing jing shui ge mei de ji huo ji zhi 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）dui P.putida 5Blai yuan de jing shui ge mei PpNHasejin hang ya ji rong ge chong gou ,huo de le huo xing he wen ding xing jun da fu di gao de ya ji rong ge xing jing shui ge mei 。ji yu M.brevicollischan lian jing shui ge mei de dan bai jie gou te dian ,cai yong ya ji rong ge ce lve dui PpNHasejin hang gai zao ,huo de le liang chong huo xing he wen ding xing jun da fu di gao de ya ji rong ge xing jing shui ge mei 。ji zhong gong biao da diao kong dan bai de rong ge xing jing shui ge mei NHase-（BA）P14Kde bi mei huo bi PpNHasedi gao le 54%,er rong ge le diao kong dan bai de rong ge xing jing shui ge mei NHase-（BAP14K）de bi mei huo jiao PpNHasedi gao le 39%,liang zhe zai 50°Cde ban cui ji fen bie wei PpNHasede 2.8bei he 2bei ,dui yan xian an de chan wu nai shou xing ye jiao PpNHaseyou yi ding de di gao 。（2）ji yu ban li xing gai zao ,jin yi bu di gao jing shui ge mei de wen ding xing 。yi NHase-（BA）P14Kwei chu fa dan bai ,tong guo jie ge dian tu bian sao miao cheng xu he fen zi dong li xue mo ni shou duan ,jian li le yi ge gao xiao de xiao xing tu bian ku ,bing cong zhong shai shua chu san ge mei huo he wen ding xing jun di gao de tu bian ti B-M150C、B-T173Yhe B-S189E,ji cui hua xiao lv jiao chu fa dan bai di gao le 1.1bei 、1.5bei he 2.2bei ,zai 50°Cde ban cui ji fen bie jiao chu fa dan bai di gao le 32%、7%ji 107%。（3）jie xi le rong ge xing jing shui ge mei de cheng shou huo hua ji li 。tong guo you hua biao da ce lve ,huo de le lai yuan yu P.putida 5Bhe R.rhodochrous J1de jing shui ge mei diao kong dan bai P14Kji NhlE。zai ci ji chu shang dui jing shui ge mei ji huo ji zhi jin hang le tan jiu 。yong chan du de diao kong dan bai zai ti wai yu tong yuan de bu han gu de rong ge xing jing shui ge mei jin hang hun ge hou ,huo de le huo hua de cheng shou mei ;ci wai ,yong diao kong dan bai ji huo bu tong lai yuan de jing shui ge mei ,ye ke yi shi xian bu fen ji huo 。ben jie guo biao ming ,diao kong dan bai qi zhao lei shi jin shu ban sui zi de zuo yong ,xie zhu shu song gu li zi dao jing shui ge mei zhong ;ling wai ,diao kong dan bai bu jin ke yi ji huo tong yuan jing shui ge mei ,ye neng ji huo yi yuan jing shui ge mei ,dan dui yu zi shen lai yuan de jing shui ge mei you zhao geng gao de ji huo xiao lv 。（4）cheng gong biao da M.brevicollislai yuan de chan lian jing shui ge mei Mb NHase。yi da chang gan jun zuo wei biao da su zhu dui Mb NHasejin hang le ke rong xing biao da ,bing ce ding le ji bi mei huo wei 88.4 U·mg-1。gen ju diao kong dan bai ke yi ji huo yi yuan jing shui ge mei de jie lun ,gou jian le MbNHaseyu liang chong diao kong dan bai P14K、NhlEgong biao da de zhi li ,biao da chun hua hou mei huo ce ding fa xian ,bi mei huo fen bie wei 220.2 U·mg-1he 127.0 U·mg-1,shi MbNHasede 2.5he 1.4bei 。jie guo biao ming ,liang chong xi jun lai yuan de diao kong dan bai ke yi xie zhu zhen he lai yuan de tian ran rong ge xing jing shui ge mei di gao huo xing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的夏媛媛，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于腈水合酶论文,调控蛋白论文,亚基融合论文,亚基自身交换原则论文,金属伴随子论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：腈水合酶论文; 调控蛋白论文; 亚基融合论文; 亚基自身交换原则论文; 金属伴随子论文; 江南大学2019-10-21论文;