BMSCs向胰岛素细胞定向诱导分化及肠壁内自体移植治疗糖尿病的实验研究

论文摘要

糖尿病（diabetes mellitus,DM）是目前危害人类特别是老年人健康的主要疾病之一,已成为导致全球人口死亡的第四大疾病。目前全球糖尿病患者已超过2.5亿人,在20年内就可能增至3.8亿人。全球每10秒钟就有2人被诊断为糖尿病,1人死于糖尿病相关性疾病。它是一种慢性非传染性疾病,由体内胰岛素缺乏或耐受所致。糖尿病可分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病等,其中Ⅰ型糖尿病的病因是在遗传易感基因的基础上在外界环境因素的作用下,引发机体自身免疫功能紊乱,导致胰岛β细胞的损伤和破坏,最终使胰岛素分泌绝对不足。目前临床上治疗糖尿病的主要方法是药物治疗和饮食疗法,虽然可以在一定程度上控制症状和避免并发症的发生,但只能治标,不能治本,于是胰岛细胞移植便成了治疗糖尿病最有希望的治本方法。供体胰岛细胞不足和免疫排斥限制了这种治疗方法的应用。近年来,随着干细胞理论和干细胞技术的发展,利用干细胞定向诱导分化和干细胞移植技术治疗糖尿病的研究成了糖尿病治疗研究中的一大热点。干细胞（stem cell）是一类具有自我复制和多向分化潜能的的早期未分化细胞,在适宜的条件下或给予适宜的信号,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。根据干细胞分化潜力的不同,干细胞可以分为全能干细胞（totipotential stem cell）、多能干细胞（multipotentialstem cell）和单能干细胞（unipotential stem cell）,单能干细胞又称为组织特异性干细胞（tissue-specific stem cell）或成体干细胞（adult stem cell,ASC）。成体干细胞存在于多种组织和器官中,具有自我复制能力,并能够分化为所在组织的细胞,补充失去生理功能的细胞或修复损伤,以维持组织内环境的稳定。现已明确,不仅胚胎干细胞可以纵向分化为不同组织的前体细胞,进而发育成相应组织的功能细胞,成体干细胞在特定的条件下也可以横向分化为其它组织细胞。由于成体干细胞取材相对容易,来源丰富,可实现个体化治疗、避免了免疫排斥反应及无伦理道德等问题而具有广阔的应用前景。已有的研究发现胰腺导管上皮细胞、肝卵圆细胞等都有成体干细胞的特性。但因上述细胞来源和自我更新增殖能力有限,诱导分化得到的胰岛素分泌细胞量少,难以成为细胞治疗的种子细胞。骨髓中含有造血干细胞（hematopoieticstem cell）和间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）。研究发现,BMSCs在体内外不同的微环境中可以被诱导分化为多种细胞类型。由于BMSCs具有易于分离培养和体外扩增,并可自体移植无免疫排斥反应的特点,因此利用BMSCs的横向分化潜能,可以根据需要将其诱导分化为特定的组织细胞,用以修复受损的组织或器官。体内可供胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells,IPCs）移植的部位很多,实验中采取的大多数移植部位还没有应用于临床。以往肝脏被认为是最合适的移植部位。然而,研究者们越来越认识到肝脏的生理和解剖特性可以促使移植细胞的死亡;另外,手术方法也限制了足量的移植细胞进入肝门静脉循环。Bendayan和Park报道了十二指肠隐窝和肌层间的结缔组织中存在典型的胰岛结构。他们还发现,链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病大鼠的十二指肠壁中的胰岛主要包含胰高血糖素细胞,胰岛素分泌细胞已消失。研究发现,小肠黏膜下层能产生各种有利于细胞的生长因子,例如成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2）、转化生长因子（transforming growth factor）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor）等。近来的研究也证实了体外培养于小肠黏膜下层的人胰岛可以保持较高的功能。体内的实验研究也表明,移植到黏膜下层的胰岛也可以保持较高的功能。基于上述理念,我们设计了该项研究,目的是为了探讨干细胞自体移植治疗糖尿病的可行性,为此类疾病的治疗提供一条新途径。本研究由三部分组成,即骨髓间充质干细胞的分离培养和诱导分化;大鼠糖尿病动物模型的建立;胰岛素分泌细胞十二指肠壁内自体移植治疗糖尿病。论文发表于“The AnatomicalRecord”。第一部分骨髓间充质干细胞的分离培养和诱导分化骨髓间充质干细胞的分离培养和体外扩增是进行干细胞诱导分化研究的前提。骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量很少,106个骨髓单个核细胞中仅含有2～5个BMSCs,因此要获得足量细胞用于后续的诱导分化和自体移植实验,大量扩增纯化是十分必要的。本实验根据BMSCs密度比较低和容易贴壁生长的特点,采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法。首先用淋巴细胞分离液经过梯度离心去除大部分的造血细胞,再通过贴壁培养、换液去除悬浮生长的造血细胞,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养扩增。结果显示,经密度梯度离心获得的细胞,原代培养4d时即可形成由BMSCs组成的细胞集落;约7～8d时,集落内细胞密集,细胞分裂相减少;用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞,含血清培养基中止消化,进行传代培养,传代细胞增殖较快,约5d可传一代,传至3代时经流式细胞术证实得到较纯的BMSCs。在成功分离培养BMSCs的基础了上,我们进行了干细胞体外定向诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究。经过多次实验,我们成功地摸索出了一个BMSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞的最佳方案:取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,按2×105/ml密度接种于6孔板中,每孔加2ml含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor,bFGF）、10ng/ml表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和2%的B27的L—DMEM培养基;培养6天后,去除旧培养液,用D-Hank’s液冲洗3遍,然后将细胞培养于含10ng/ml肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、10ng/mlβ细胞调节素（β—cellulin）、10ng/ml活化素A（activinA）、10mmol/L尼克酰胺和2%B27的H—DMEM培养基中,继续培养6天。诱导6天时细胞形态略有变化,多呈圆形,少数细胞呈多角形或长梭型,折光性明显增强,开始出现小的细胞簇;第12天时多数细胞已聚集成簇,结构类似胰岛。RT-PCR结果显示,分化细胞能表达胰岛β细胞分化和内分泌功能相关基因。进一步的Western blot和胰岛素免疫细胞化学染色结果表明,分化的细胞能合成和表达胰岛素。这一部分实验的结果说明,我们所设计的复合诱导剂可诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为功能性胰岛β细胞,从而为进一步的细胞自体移植治疗糖尿病提供了细胞来源。第二部分大鼠糖尿病动物模型的建立建立一稳定可重复的糖尿病动物模型是进行细胞移植治疗实验研究的基本条件。我们选用大鼠为实验动物,用腹腔注射链脲佐菌素的方法,选择性的破坏胰岛β细胞,成功地建立了该病的动物模型。给药后,大鼠出现明显多饮、多食、多尿、体重下降。大鼠空腹血糖测试结果显示,注射后3d模型组血糖明显升高,超过16.7mmol/L,与给药前血糖相比有显著性差异（P＜0.01）,而对照组给药前后血糖无显著性差异（P＞0.05）。给药后1周、2周、3周、4周血糖检测结果显示,模型组大鼠血糖逐渐升高,始终保持在16.7mmol/L以上;而对照组大鼠血糖水平保持正常,两组相比有显著性差异（P＜0.01）。大鼠体重检测结果表明,给药后,模型组大鼠的体重持续下降;而对照组大鼠的体重保持增加,两组相比有显著性差异（P＜0.05）。给药后2周和4周处死模型鼠取胰腺,进行石蜡切片,常规HE染色和胰岛素免疫组化染色,光镜观察显示,胰岛素阳性表达的β细胞明显减少,HE染色可见胰腺外分泌细胞无异常,未发现炎性细胞浸润;在对照组中可观察到胰岛素阳性表达的胰岛β细胞无异常表现。该动物模型的成功建立,为干细胞移植治疗该病的实验研究提供了前提条件。第三部分胰岛素分泌细胞十二指肠壁内自体移植治疗糖尿病在成功建立动物模型的基础上,我们从模型鼠的股骨和胫骨中取骨髓间充质干细胞,定向诱导分化12天后,自体移植到供体鼠的十二指肠壁内,并设手术对照组。细胞移植1周后,血糖检测结果显示,胰岛素分泌细胞移植治疗组大鼠血糖恢复正常,而对照组大鼠血糖仍维持高值,两组间有显著性差异（P＜0.01）;腹膜腔内糖耐量实验表明,细胞移植治疗组大鼠血糖反应曲线与正常对照组相近。移植后2、4和8周,组织学检测结果显示,移植细胞存活良好,主要存在于肠壁的黏膜下层,少部分分布于粘膜层;随着移植时间延长,细胞逐渐聚集形成细胞簇,胰岛素免疫组织化学染色呈阳性。这说明移植细胞能够在十二指肠壁内存活,并能分泌胰岛素,受体动物可恢复正常血糖水平。结论本项研究通过建立糖尿病的大鼠实验模型,成功地分离培养、体外扩增和鉴定了骨髓间充质干细胞,优化了体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的条件,成功地将诱导分化后的胰岛素分泌细胞进行糖尿病大鼠十二指肠壁内自体移植并进行了多项移植后检测,结果显示:移植细胞在肠壁内存活,并呈现胰岛素免疫组化阳性着色,糖尿病症状明显改善,说明对糖尿病有明显治疗效果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的体外分离培养和诱导分化
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 大鼠糖尿病动物模型的建立
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第三部分 胰岛素分泌细胞十二指肠壁内自体移植治疗糖尿病
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
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