Cdc42在小鼠触须毛囊发育中作用的初步研究

论文摘要

毛囊是皮肤重要的附属结构,主要作用在于调控毛发的生长,在个体中分布很广,几乎遍及全身。毛发由排列规则的角化上皮细胞组成,对个体具有保护、保温、排泄、分泌汗液、感觉和传导信息以及装饰作用。胚胎时期毛囊的形态发生依赖于上皮细胞与真皮乳头间的相互作用,真皮乳头诱导毛囊从被覆上皮发生。毛发生长具有周期性,经历着生长期、退行期和静止期的自我更替,这种周期性的生长和脱落有赖于毛囊外根鞘隆突处的干细胞。毛囊的形态发生及周期性生长受多种细胞因子及复杂的信号通路所调节,但其调控机制尚不完全清楚,这对临床脱发性疾病的治疗造成了阻碍。因此,研究毛囊生物学及周期性生长调控机制的成为目前的热点。Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白（Rho GTPase）中的一员,全称为细胞分裂周期蛋白42 （Cell division cycle 42）,具有GTP酶活性,可在有活性GTP和无活性GDP间灵活转换,在细胞信号转导过程中具有分子开关的作用。Cdc42最初在酵母细胞中发现,生物活性十分广泛,在调控细胞骨架、细胞极性、细胞形态发生和细胞迁移方面具有重要作用。除了对细胞骨架等的调节外,Cdc42对细胞增殖、分化也有重要调节。由于以往对Cdc42的研究大多局限于细胞水平,随着人类基因组计划及各种基因工程技术的深入开展,条件性基因敲除技术利用Cre/Loxp重组酶系统使人们能够更好的在个体水平对Cdc42蛋白的功能进行研究。目前一些研究已发现,Cdc42突变小鼠在胚胎发育的早期死亡,提示：Cdc42对胚胎发育具有至关重要的作用。角蛋白14（K14）/K5启动子经常被用于目的基因的敲除,它在内根鞘和表皮基底层具有一定的活性。通过K14特异性敲除小G蛋白Rho家族蛋白另一成员Rac1,发现Rac1敲除不仅损害毛囊完整性,而且也破坏了表皮和皮脂腺的自我更新。通过K5特异性敲除Cdc42发现小鼠出生2周后毛发显著减少,研究表明Cdc42可通过抑制β-catenin降解而促进表皮干细胞向毛囊系的分化。而本实验通过K14作为启动子构建表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠（Cdc42loxp/loxpCre+,简称KO小鼠）,我们发现：与正常对照组WT小鼠相比,出生时P1天,触须就已经表现出生长异常,皮肤表面未见毛干长出,这表明：Cdc42的敲除影响了胚胎时期毛发的生长,提示：Cdc42在胚胎时期毛囊的发育及毛发生长中发挥着重要作用,然而Cdc42与毛囊结构发生、形成的关系尚不清楚,我们就此展开了本课题的实验研究。一、表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠的建立和基因型鉴定（一）目的构建表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠,为进一步研究Cdc42在毛囊发育中的作用奠定基础。（二）方法将所引进的KRT14-Cre小鼠和Cdc42loxp/loxp进行饲养并繁殖,并杂交得到F1代小鼠,提取子鼠鼠尾基因组DNA,利用PCR方法扩增目的基因片段,根据基因片段长度筛选出基因型为Cdc42loxp/+Cre+小鼠,并与基因型Cdc42loxp/lxop回交,进而构建Cdc42loxp/lxopCre+小鼠。（三）结果1.KRT14-Cre小鼠和Cdc42loxp/loxp杂交后F1代及F2代繁殖结果符合孟德尔遗传定律,并成功得到基因型为Cdc42loxp/loxpCre+小鼠。2.小鼠杂交繁殖顺利,其妊娠期为19-21天,每胎平均产仔6-8只,体重约为0.9—1.2g。基因型为Cdc42loxp/loxp Cre+ KO小鼠面部胡须部位光滑,仅见毛囊突起,未见触须毛干,且KO小鼠在24h内全部死亡。（四）结论1.成功构建表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠。2.Cdc42基因缺失造成胚胎时期小鼠触须生长异常。二、胚胎时期小鼠触须毛囊的形态发生规律（一）目的观察胚胎时期触须毛囊形态及发生规律,为毛囊发育生物学研究及分子调控机制提供组织形态学基础。（二）方法取E10.5-E18.5小鼠胚胎及1d新生鼠（P1）的触须部位皮肤,采用石蜡切片、常规HE染色,观察胚胎时期小鼠触须毛囊的发生过程及其形态学特征。（三）结果1.E10.5可见小鼠触须部位皮肤表皮极薄,细胞排列整齐,为复层上皮,未见表皮有局部增厚区及细胞的数量局部增多,可见核的局部聚集现象,此时小鼠触须部皮肤毛囊处于基板形成前期。2.E12.5可见表皮由1—2层角质形成细胞组成,细胞为立方形,大小较一致,排列整齐且紧密。局部表皮增厚且细胞呈柱状排列,细胞长轴与基底层垂直,其下部间充质细胞数量局部增多并聚集,并有略微的方向改变,呈现出一定的极性,形成对称分布的毛囊基板结构。3.E13.5表皮基底层细胞内陷,形成短小圆柱状结构,并与表皮呈现一定的角度。基底细胞成梭形排布,内陷细胞排列不规则,形成毛胚芽结构。真皮细胞在毛胚芽底部有少量的聚集,细胞排列方向改变,其为毛乳头形成的前体细胞。此时处于毛囊形成的第2阶段,毛胚芽形成期。4.E14.5表皮基底层细胞进一步下陷,形成一个细长的圆柱状结构,由复层细胞组成,中间为较多立方核状细胞,外层细胞核呈柱状,成栅状整齐排列,细胞质少而胞核深染,圆柱状结构内细胞开始发育成内根鞘的锥形结构,上层环绕整个毛囊的结缔组织鞘形态也清晰可辨。同时在还可见毛囊近端出现球状结构,并且该结构内出现毛乳头样结构,圆锥状的毛乳头内陷进入毛母质细胞包裹的毛乳头腔。此时,毛囊发育已进入毛丁期及毛囊期早期阶段。5.E15.5-E16.5毛囊发育进入毛囊期,出现毛囊特征性结构。E15.5天,毛囊原基的末端膨大,呈球状,细胞围绕毛囊轴呈同心圆排列。真皮乳头细胞伸入而内陷,毛乳头周围细胞成柱状或立方形,胞核较大为毛母质细胞,毛母质细胞包绕毛乳头形成毛球结构。E16.5天,在毛囊上三分之二处可见毛囊突起（bulge）开始形成,毛囊进一步下陷,到达深层皮下组织；内外根鞘结构清晰可见,其内部为一层相互连叠的长卵圆形的细胞,其长轴与毛发生长方向平行的内根鞘小皮。外部可见一层排列紧密的细胞,细胞较小,细胞核扁平的亨勒层；外根鞘与表皮基底层相连,可见毛囊的典型结构。6.E17.5-P1,毛干尖端脱离内根鞘,进入毛道漏斗部,毛囊已经下陷至皮下肌层,此时毛囊发育已基本成熟,并进入毛囊周期循环的生长期。（四）结论1.小鼠触须部位毛囊发育过程与Paus R等对毛囊发育和再生的分期一致,大致分为5个阶段,分别为基板形成早期、基板形成期、毛胚芽期、毛丁期和毛囊期。2.小鼠出生时触须部位毛囊于E12.5天时诱导发生,早于小鼠腹部及背部的皮肤。E16.5天时毛囊典型结构已形成,E17.5-P1天,毛囊进一步成熟,并进入毛囊生长期。3.胚胎时期小鼠胡须部位毛囊的生长发育非同步,同一时期可见不同发育阶段的毛囊。三、Cdc42对小鼠毛囊发育的影响（一）目的初步研究Cdc42在毛囊生长发育及生长周期中的作用,为毛囊生长发育及生长周期中的作用机制提供理论依据。（二）方法本研究运用Cre/LoxP重组酶系统构建了表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠,分别取同窝E15.5、E17.5胎鼠及P1新生小鼠,利用PCR等方法对小鼠进行了基因型的鉴定后分组。在此基础上,本研究运用了HE染色观察的毛囊的形态结构、数量、毛干的长度,免疫组织化学（IHC）手段检测了毛囊特异性角蛋白及相关蛋白的表达,并利用BrdU标记方法研究了Cdc42在调节触须毛囊细胞增殖过程中发挥的作用。（三）结果1.E15.5天,WT小鼠基底层细胞内陷形成的毛胚芽中Cdc42呈阳性表达,与对照组WT小鼠相比,KO小鼠毛胚芽中Cdc42的表达明显减少。结果提示,E15.5天,转基因小鼠触须毛囊Cdc42 GTPase活性有效下调,小鼠构建成功。2.P1天,体式显微镜下观察,WT小鼠触须部位可见白色透明毛干长出,而KO小鼠触须部位仅见毛囊的凸起状结构,但未见毛干生长。3.P1天,HE染色可见WT、KO小鼠毛囊外根鞘、内根鞘结构,毛球部毛母质细胞包绕毛乳头,毛囊的典型结构基本形成,两者基本形态上无显著差异（如图3-4）。触须部位毛囊的数量没有统计学差异（P=0.35）。触须部位毛囊长度具有统计学差异（P<0.01）,WT小鼠毛囊平均长度为（218.6±25.1μm）,而KO小鼠仅（152.1±18.7μm）。4.E17.5天,K15在WT小鼠毛囊外根鞘细胞中呈阳性表达,KO小鼠毛囊外根鞘细胞阳性表达较少（P<0.01）；P1天,K15在WT小鼠毛囊外根鞘细胞中呈强阳性表达,与WT小鼠相比,KO小鼠毛囊外根鞘细胞中未见K15阳性细胞表达（P<0.01）。E17.5天,K19在WT、KO小鼠在毛囊外根鞘细胞中呈强阳性表达,表达无显著差异；P1天,K19在WT小鼠毛囊外根鞘及毛母质细胞中成阳性表达,而在KO小鼠毛囊外根鞘表达较少,且毛母质细胞几乎不表达（P<0.01）。结果提示：KO小鼠毛囊干细胞的数量显著减少。5.E17.5天,WT小鼠K6阳性细胞主要分布于毛囊外根鞘细胞中,在内根鞘细胞和表皮层细胞中均未见阳性染色；而在KO小鼠毛囊中除外根鞘细胞外,内根鞘细胞中也呈阳性表达,且在基底上层也可见散在分布的阳性颗粒。P1天,WT小鼠K14阳性细胞特异性的分布于表皮基底层及毛囊外根鞘细胞,在基底上的棘层细胞中未见阳性染色；而KO小鼠毛囊中除表层基底层外,棘层细胞中也见阳性表达,且外根鞘中表达增多。P1天,K1在KO、WT小鼠表皮的基底上层中呈阳性表达,其他部位无异常表达,且二者无明显差异,结果提示：在E17.5天,毛囊组织处于过度增殖状态,向表皮层分化增多,但其终末分化未受影响。6.E17.5天,WT小鼠β-catenin阳性细胞散在分布于毛囊外根鞘及毛球细胞的胞膜中,在KO小鼠毛囊中β-catenin成阳性表达于毛囊的内根鞘、外根鞘及毛球胞浆及胞核中,其表达强于WT小鼠（P<0.01）。E-cadherin与β-catenin表达趋势具有一致性。结果提示：Cdc42敲除造成KO小鼠β-catenin及E-cadherin表达异常,影响了细胞间黏附作用及细胞的增殖、分化。（四）结论Cdc42在小鼠毛囊生长发育中发挥重要的作用,表现在以下三个方面：1)Cdc42是维持毛囊干细胞稳定的必要条件。2)Cdc42在调控细胞黏附作用中发挥着积极的作用。3)Cdc42介导E-cadherin和β-catenin调控毛囊干细胞的增殖及分化而发挥生理效应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 表皮特异性Cdc42基因敲除小鼠的建立及鉴定
• 引言
• 1.1 材料和仪器
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二章 胚胎时期小鼠触须毛囊的形态发生
• 引言
• 2.1 材料和仪器
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 Cdc42对小鼠毛囊发育的影响
• 引言
• 3.1 材料和仪器
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 攻读学位期间成果
• 致谢