论文摘要
脂肪酶是一种酯键水解酶,它们能够进行非水相催化的特性使其能够用于生产许多高附加值的、用化学方法难以合成的水不溶性产品,目前在非水介质中的脂肪酶催化反应已经被成功应用在多肽合成、聚合物合成、药物合成、立体异构体拆分、精细化工、食品和香料生产及油脂改性等,成为当前生物技术领域的一个研究热点。本论文主要从脂肪酶产生菌的筛选、发酵条件优化、诱变育种、脂肪酶基因的克隆、脂肪酶在有机相中的催化等几方面进行了研究。本论文首先经过富集、平板初筛及摇瓶复筛试验,筛选到具脂肪酶活的菌株80余株,其中C3酶活较高。C3和G5固定化脂肪酶能够高效催化转酯反应生产生物柴油。通过对C3和G5进行18S rDNA分析,结合形态观察,初步确定此两株菌都属于地霉菌属（Geotrichum）。对C3胞外粗酶液酶基本性质的研究表明:C3脂肪酶胞外粗酶液作用的最适温度为40℃,最适作用pH为7.5,在50℃以内和pH6.0～8.0之间有较好的稳定性。随后,对筛选到的C3菌株液体摇瓶产脂肪酶的条件进行了优化。确定其最适产酶条件为:黄豆粉1.5 g蛋白胨1.0 g硫酸铵0.5 g蔗糖1.5 g KH2PO4 0.1 g MgSO4·7H2O 0.05 g橄榄油1 mL H2O 100 mL pH 6.5。然后,用紫外线及EMS对G5进行诱变育种。结果证明EMS诱变效果较好。G5经EMS诱变后传代3次,酶活比出发菌株提高了168.6%。我们根据G.geotrichum脂肪酶基因核酸序列的保守区域,利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术扩增得到了G5脂肪酶基因的全序列,此基因没有内含子,全长1692bp,编码563个氨基酸,对其进行了生物信息学分析。最后,对固定化的G5脂肪酶在有机相中催化转酯化反应进行了尝试,此酶可以转化橄榄油、棉籽油、煎炸废油等多种底物生产生物柴油,对橄榄油的酯化率达到54%。在有机相中还利用此G5脂肪酶对生物表面活性剂槐糖脂进行了结构修饰,对修饰后的槐糖化酶脂的抑菌活性进行了研究,实验证明,通过修饰提高了其对石膏样毛癣菌和红色毛癣菌的抑制作用,对白色念珠菌有一定抑制作用,对犬小孢子菌的抑制作用改变不大。
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目录摘要Abstract第一章 绪论1.1 脂肪酶在非水相系统中的催化作用1.1.1 用于非水反应体系的主要非水介质1.1.2 非水介质中脂肪酶的结构和非水相催化的特性1.2 非水相中脂肪酶的性质变化1.3 影响非水相中酶催化活性的主要因素1.4 脂肪酶在工业领域中的应用1.4.1 应用脂肪酶法制备生物柴油1.4.2 应用脂肪酶在非水相中催化修饰槐糖脂第二章 脂肪酶高产菌种的选育及其粗酶性质研究2.1 导言2.2 材料和方法2.2.1 主要试剂2.2.2 主要仪器2.2.3 土样采集2.2.4 培养基2.2.5 方法2.3 结果2.3.1 菌种筛选2.3.2 产脂肪酶菌株C3、G5的鉴定2.3.3 C3产酶培养基的优化2.3.4 C3脂肪酶的酶学性质2.3.5 产脂肪酶菌株G5的诱变育种2.4 本章小结第三章 G5脂肪酶基因的克隆及分析3.1 引言3.2 试剂与材料3.2.1 菌株3.2.2 试剂3.2.3 培养基3.3 仪器与方法3.3.1 仪器3.3.2 G5基因组DNA的提取3.3.3 PCR扩增G5的脂肪酶基因3.3.4 克隆、测序与序列分析3.4 结果与讨论3.4.1 G5基因组的提取3.4.2 G5脂肪酶基因中间序列的扩增3.4.3 G5脂肪酶中间片段的测序及结果分析3.4.4 TAIL-PCR方法扩增G5脂肪酶基因的5′端序列3.4.5 TAIL-PCR方法扩增G5脂肪酶基因3′端序列3.4.6 G5脂肪酶全长基因的克隆3.4.7 扩增的G5脂肪酶全长序列分析3.4.8 蛋白理化性质预测3.4.9 氨基酸序列分析与同源性比较3.4.10 信号肽的分析3.4.11 G5脂肪酶基因的二级结构预测3.4.12 蛋白的同源建模3.5 本章小结第四章 G5脂肪酶在非水相中的催化作用第一节 生物柴油的生产4.1.1 引言4.1.2 材料与方法4.1.3 结果与讨论4.1.3.1 酶对甲醇的耐受性4.1.3.2 固定化酶催化转酯化反应生产生物柴油第二节 G5脂肪酶对槐糖脂的修饰及对其抑菌活性的影响4.2.1 引言4.2.2 材料与方法4.2.3 结果及分析4.2.3.1 碱水解后及修饰后产物的高效液相色谱分析4.2.3.2 修饰后抑菌活性的变化本章小结参考文献致谢学位论文评阅及答辩情况表
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