角膜真菌感染黏附分子机制的实验研究

论文摘要

目的:通过构建真菌与角膜上皮细胞相互作用的三种模型,探讨角膜真菌感染过程中黏附的分子机制和生物学效应。方法:第一部分真菌激活人角膜上皮细胞FAK信号转导通路的体外实验研究将三种常见致病真菌（白色念珠菌、烟曲霉菌和茄病镰刀菌）分别与人角膜上皮细胞共孵育,MTT法检测FAK信号通路抑制剂染料木黄酮（genistein）的对人角膜上皮细胞的细胞毒性作用;RT-PCR检测真菌黏附人角膜上皮细胞后不同时间细胞外基质层连蛋白（LN）、纤连蛋白（FN）、玻连蛋白（VN）、Ⅳ型胶原（COLIV）、跨膜蛋白整合素αV（ITGαV）、整合素β1（ITGβ1）,以及FAK信号通路中FAK1、FAK2和桩蛋白（PAX）基因的表达情况;Western blot的方法检测黏附信号转导途径相关蛋白ITGβ1、FAK和PAX的表达,以及染料木黄酮对真菌刺激人角膜上皮细胞FAK信息通路活化的抑制作用;免疫细胞化学方法观察人角膜上皮细胞与真菌相互作用过程中LN、FN和FAK的表达;激光共聚焦显微镜对FN、FAK和PAX进行了细胞定位,并观察真菌刺激后人角膜上皮细胞骨架的变化;流式细胞仪定量检测人角膜上皮细胞ITGβ1与PAX在真菌黏附后表达的改变;光学显微镜观察真菌与人角膜上皮细胞黏附数量,记录并测定了黏附后积分光密度值（OD）;扫描及投射电镜观察了真菌与人角膜上皮细胞黏附后,细胞超微结构的改变。第二部分真菌对人角膜上皮细胞黏附移行能力的影响利用Transwell小室构建真菌与人角膜上皮细胞共培养体系,建立三种常见致病真菌（白色念珠菌、烟曲霉菌和茄病镰刀菌）与人角膜上皮细胞相互作用的模型,实验共分四组,第一组:人角膜上皮细胞接种于上室内凝胶上,待80%融合后在下室加入108CFU（colony forming unit）/ml的真菌悬液,进行共培养;第二组:用染料木黄酮（200μM）200u1预先与细胞共培养60min后再加入上述浓度的真菌在下室;第三组:用染料木黄酮（200μM）200 u1预先与细胞共培养60min,吸去上清,用DMEM反复冲洗后,下室中加入一定体积的DMEM培养基;第四组:以未用抑制剂和真菌刺激的细胞作为空白对照,各组相互作用48h,对穿过Matrigel到达滤膜下方的人角膜上皮细胞进行HE染色,拍照记录并测定积分光密度,以评价真菌及其代谢产物对人角膜上皮细胞移行功能的影响,并进一步探讨FAK在上述过程中的作用。第三部分黏附相关蛋白在小鼠角膜真菌感染中的表达选用近交系BALB/c小鼠,应用角膜表层镜法,即在小鼠角膜表面覆盖大鼠角膜片,二者层间注入菌液（106CFU）,缝合眼睑,建立三种常见致病真菌（白色念珠菌、烟曲霉菌和茄病镰刀菌）的真菌性角膜炎动物模型。染料木黄酮处理组在角膜接种菌液前60min,环绕实验眼角膜缘球结膜下注射FAK特异性抑制剂染料木黄酮（200μM）10u1,实验组注射等量0.02MPBS。裂隙灯显微镜观察接种菌液后6、12、18、24和48h角膜病变特点,拍照记录;应用HE染色进行组织病理学观察;应用免疫组织化学方法检测以上各时间点LN、ITGβ1和FAK蛋白的表达情况。结果:第一部分MTT法检测FAK抑制剂（染料木黄酮）终浓度200uM是对细胞毒性较小的最大抑制浓度。细胞外基质（LN、FN）、跨膜蛋白整合素ITGβ1,以及FAK信号通路中FAK和PAX基因均参与真菌与人角膜上皮细胞的黏附过程;FAK信号转导途径在人角膜上皮细胞与真菌接触后快速启动并激活下游蛋白,应用抑制剂后信号蛋白表达均不同程度减低;免疫细胞化学观察人角膜上皮细胞与真菌相互作用过程中LN、FN和FAK表达均增强,其中FAK表达呈强阳性;激光共聚焦显微镜显示FN定位于细胞外基质,FAK和PAX定位于细胞膜的内表面,并发现真菌刺激后,细胞骨架发生明显变化;流式细胞仪检测结果提示真菌与ITGβ1在瞬间迅速结合,染料木黄酮可明显抑制PAX表达;光学显微镜和积分光密度结果进一步证实了真菌黏附及染料木黄酮的抑制作用;电子显微镜观察到真菌黏附后人角膜上皮细胞出现细胞器结构紊乱、胞膜边缘波动和细胞内吞等超微结构的改变。第二部分利用Transwell小室成功构建三种常见致病真菌与人角膜上皮细胞相互作用的模型,接种真菌及其代谢产物刺激人角膜上皮细胞48小时后,结果发现,真菌可显著增强细胞的移行能力;用FAK抑制剂染料木黄酮先与位于Transwell上室的人角膜上皮细胞作用后发现,与未受FAK抑制剂作用的人角膜上皮细胞相比,FAK抑制剂不仅能降低人角膜上皮细胞固有的移行能力,且可明显降低真菌诱导的移行能力增强作用。第三部分裂隙灯显微镜观察接种菌液后6、12、18、24和48h,实验组和染料木黄酮处理组角膜上皮不同程度地弥漫性水肿、混浊,病变进行性加重;HE染色组织病理学观察结果提示角膜接种菌液后实验组和染料木黄酮处理组角膜上皮组织均有不同程度的水肿增厚,24h和48h组局部出现炎细胞浸润;免疫组织化学检测LN、ITGβ1和FAK均有表达,FAK的表达呈强阳性,染料木黄酮处理组FAK表达明显减低。结论:真菌刺激人角膜上皮细胞,通过活化细胞外基质,结合跨膜受体,激活FAK信号转导通路,可以增强角膜上皮细胞与真菌黏附能力,FAK抑制剂可有效减弱真菌诱导的人角膜上皮细胞的黏附功能。通过真菌刺激人角膜上皮细胞FAK信号转到通路活化,可以增强角膜上皮细胞与真菌移行能力,FAK抑制剂可减弱真菌诱导的人角膜上皮细胞黏附移行等生物学行为的改变。黏附是真菌侵入体内并发挥作用的前提,FAK信息通路的快速激活是角膜上皮细胞对真菌感染做出应答的一个早期事件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 真菌激活人角膜上皮细胞FAK信号转导通路的体外实验研究
• 前言
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 真菌悬液的制备
• 1.1.3 仪器和试剂
• 1.1.4 实验室检查
• 1.1.5 统计学处理
• 1.2 结果
• 1.2.1 细胞的形态观察
• 1.2.2 细胞毒性试验
• 1.2.3 积分光密度测定
• 1.2.4 电镜观察结果
• 1.2.5 实验室检查结果
• 1.3 讨论
• 第二章 真菌对人角膜上皮细胞黏附移行能力的影响
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器和试剂
• 2.1.2 细胞移行实验
• 2.1.3 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 细胞移行能力
• 2.2.2 染料木黄酮抑制效应
• 2.2.3 统计学结果
• 2.3 讨论
• 第三章 黏附相关蛋白在小鼠角膜真菌感染中的表达
• 前言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 真菌菌种
• 3.1.3 材料和仪器
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 动物实验结果
• 3.2.2 病理检查结果
• 3.2.3 免疫组化实验结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 细胞表面配基识别
• 3.3.2 真菌黏附分子机制
• 3.3.3 角膜真菌黏附分子机制
• 结论
• 实验附图
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢