论文摘要
活性羰基化合物是糖代谢或者脂质氧化代谢的产物。它会引起蛋白质交联,因此对各种细胞具有毒性。由于神经细胞具有较高的氧化代谢率,因此活性羰基化合物对神经细胞的毒性作用更强。甲基乙二醛（MG）等羰基化合物已经被证实作为重要的氧化损伤毒性介质参与阿尔茨海默病以及其他神经变性疾病的发病机制。在这些羰基化合物中,甲基乙二醛非常特殊,因为它主要通过磷酸丙糖的非酶促降解产生。特别值得注意的是,甲基乙二醛通过与蛋白质发生非酶促糖基化反应能够生成晚期糖基化终产物（advanced glycation end-products, AGEs）,已经证实在这一过程中会生成活性自由基。甲基乙二醛对巨噬细胞、胰岛素分泌细胞及神经元细胞具有细胞毒性。虽然几个研究已经发现甲基乙二醛能诱导非神经元细胞和神经元细胞发生凋亡,并且发现其诱发凋亡的机制可能涉及激活有丝分裂原活化的蛋白激酶家族或者激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase,JNK）,但对甲基乙二醛细胞毒性的分子机制目前仍然缺乏足够的认识。鉴于甲基乙二醛在神经变性疾病中具有重要作用,阐明甲基乙二醛神经毒性的分子生物化学机制是至关重要的。蛋白质组学方法是一种高通量筛选目的蛋白质的工具,广泛用于各种疾病致病机制、细胞内信号通路网络等的研究。利用这种技术可能进一步阐明甲基乙二醛诱导的神经变性过程中发生的分子事件。但是由于中枢神经系统细胞具有异质性,这是将蛋白质组学研究方法成功应用于研究甲基乙二醛诱导的蛋白质改变的一大障碍。为了克服样品异质性这一难题,我们应用一种特殊的细胞系对甲基乙二醛诱导的神经毒性进行蛋白质组学分析。人类SH-SY5Y成神经母细胞瘤细胞系的生物学特性已经被充分了解并被作为一种细胞模型系统广泛应用于研究各种神经毒性化合物的致病机制。此外,SH-SY5Y细胞高度表达晚期糖基化终产物受体；同时由于缺乏抗氧化及解毒能力,无法有效分解毒性产物,并会引起细胞凋亡蛋白酶-9（caspase-9）依赖性凋亡反应,因此SH-SY5Y细胞系对甲基乙二醛应激高度敏感。在本研究中,我们应用MTT检测、AO/EB荧光染色、二维荧光差异凝胶电泳、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱,测定与甲基乙二醛处理有关的蛋白质表达水平的差异,以揭示其神经毒性作用的分子生物化学机制。分别用四种不同终浓度的甲基乙二醛（0.25mM、0.50mM、0.75mM、1.00mM）处理SH-SY5Y细胞24h、48h、72h后进行MTT细胞活力检测。甲基乙二醛对SH-SY5Y细胞存活率的影响具有时间和剂量依赖性,浓度越高、处理时间越长,细胞存活率越低,与对照组相比差别非常显著（P<0.01）,具有统计学意义。每个相同时间点的4个不同MG浓度的实验组与对照组相比较,随着MG浓度的升高,细胞存活率进行性下降并呈浓度依赖性。以处理24小时后为例,4个不同浓度实验组的细胞存活率分别为82.85%、71.08%、56.85%、44.50%,呈现明显的浓度依赖性细胞存活率下降。每个相同MG浓度的3个不同作用持续时间的实验组与对照组相比,随着MG作用时间的延长,细胞存活率进行性下降并呈时间依赖性。以0.50mM浓度组为例,24h、48h、72h三组的细胞存活率分别为71.08%、55.95%、42.86%,呈现明显的时间依赖性细胞存活率下降。MG作用24小时后与对照组相比,在MG终浓度0.25mM、0.50mM、0.75mM的三个实验组,随着MG浓度的升高,SH-SY5Y细胞的凋亡率进行性升高并呈浓度依赖性；在MG浓度1.00mmM组,SH-SY5Y细胞的凋亡率低于0.75mM组,但仍高于其他各组。以上差别均有统计学意义。对照组的SH-SY5Y细胞的凋亡/非凋亡性细胞死亡比率为0.67,0.25mmM浓度组、0.50mM浓度组的凋亡/非凋亡性细胞死亡比率较对照组升高；0.75mmM浓度组、1.00mM浓度组较对照组降低；0.50mmM浓度组的细胞凋亡/非凋亡性细胞死亡比率是最高的,为0.98。蛋白质组学分析发现在甲基乙二醛处理后的SH-SY5Y细胞中有49种蛋白质表达发生改变,其中16种蛋白质表达水平上调、33种蛋白质表达水平下调。其中8种蛋白质被明确鉴定出来。结合以往的研究结果,我们推测：甲基乙二醛处理后的SH-SY5Y细胞内的β-肌动蛋白（ACTB）表达水平增高,提示β-肌动蛋白在氧化损伤诱导的细胞与组织功能障碍的致病机制中具有重要作用；甲基乙二醛处理可能通过降低人免疫球蛋白λ-轻链的含量而间接促进β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的神经毒性；甲基乙二醛可能通过降低蛋白磷酸酶2水平进而促进tau蛋白磷酸化而产生神经毒性。研究结果提示β-肌动蛋白、免疫球蛋白λ轻链和蛋白质磷酸酶-2蛋白质水平的显著差异表达在阿尔茨海默病的发病机制中可能具有重要功能作用。在本研究中,我们同时发现不育α基元域13、恶性细胞表达增强基因/肿瘤增生增强基因、紧密连接蛋白2（ZO-2）及溶质携带物家族-9（钠氢交换体）成员1（钠氢逆向转运体,钠氢交换抑制剂-阿米洛利敏感型）以及人免疫球蛋白重链等蛋白质的表达发生改变。但是这些蛋白质在神经细胞毒性方面的意义目前尚不清楚,其中紧密连接蛋白2（ZO-2）与血脑屏障的维持有关。总之,经过甲基乙二醛处理后的SH-SY5Y细胞中多种可能与阿尔茨海默病及其他神经变性疾病致病机制有关的蛋白质的表达水平发生了改变。据我们所知,这是第一次运用蛋白质组学技术发现,在经过甲基乙二醛处理后的SH-SY5Y细胞中,β-肌动蛋白蛋白质表达水平显著上调、人免疫球蛋白λ-轻链及蛋白磷酸酶2（PP2）蛋白质表达水平显著下调。因此,我们的研究结果提示有多种机制参与甲基乙二醛介导的神经元毒性。