日本落叶松×华北落叶松体细胞胚胎发生的生化机制和分子机理研究

论文摘要

植物体细胞胚胎发生是针叶树种通过生物技术手段进行规模化无性繁殖的重要途径,在林木的大量繁殖、种质保存和遗传转化等诸多领域中均具有巨大的应用价值,同时也是植物细胞全能性研究的理想模式系统。深入研究植物体细胞胚胎发生的机理,不仅有助于解决体细胞胚分化过程中存在的问题,也可揭示体细胞胚胎发生这一特定细胞分化途径的本质。本研究以杂种落叶松（Larix leptolepis×L. principis-rupprechtii）胚性细胞系Y35为研究对象,根据其体细胞胚发生过程中的形态变化,界定了体细胞胚成熟阶段的6个发育时期;以Y35胚性愈伤组织和体细胞胚成熟阶段不同发育时期的培养物为实验材料,研究了可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量以及抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的变化趋势,并利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建了原胚团阶段和体细胞胚成熟阶段的差异表达基因文库,通过半定量和Real-Time PCR进一步分析了8类25个基因在Y35体细胞胚不同发育时期的表达情况。主要结果如下:1. Y35胚性愈伤组织中的PEMⅢ在体细胞胚成熟阶段经历早期单胚、中期单胚和后期单胚,最后发育成成熟子叶胚:诱导15d时为PEMⅢ向早期单胚发育时期,514d为早期单胚向中期单胚发育时期,1421d为中期单胚向后期单胚发育时期,2128d为后期单胚向早子叶胚发育时期,28d后进入子叶胚的成熟期,其中2835d为早期子叶胚向中期子叶胚发育时期,3542d为中期子叶胚向后期子叶胚发育时期。2.对Y35体细胞胚发生过程中可溶性蛋白、可溶性糖和淀粉含量变化趋势的研究显示,可溶性蛋白含量在2.50310.782 mg·g-1FW之间,呈上升趋势,并在PEMⅢ至中期单胚开始形成和子叶胚成熟期出现两个合成高峰期;可溶性糖含量在6.66210.543 mg·g-1FW之间,淀粉含量在5.56614.970 mg·g-1FW之间,表现为升-降-升的变化趋势,两者均在PEMⅢ向中期单胚发育时期以及子叶胚成熟期上升,在中期单胚向子叶胚发育过程中下降。表明体细胞胚胎发生的早期和子叶胚成熟期是储能阶段,而子叶胚形成和体细胞胚萌发时期是高耗能阶段。3.对Y35体细胞胚胎发生过程中抗氧化酶活性变化的研究显示:（1）SOD活性在52.98133.20 U·g-1·h-1之间,并在早期单胚形成后一直保持上升的趋势,表明其与胚性细胞的分化及体细胞胚的发育均具呈正相关;（2）POD活性在0.050.50 U·mg-1·min-1之间,呈现出先下降后升高的趋势,在胚性愈伤组织中最高,而在后期单胚形成时降至最低,表明其与原胚团的分裂和分化呈正相关,但与PEMⅢ向后期单胚的发育呈负相关;（3）CAT活性在0.862.81 U·mg-1·min-1之间,表现出升-降-升的变化趋势,在早期单胚形成时升至最高,在早期子叶胚形成时降至最低,表明其与早期单胚的发育呈正相关,而与中期单胚和早期子叶胚的发育呈负相关。上述3种抗氧化酶通过相互配合,协同调节胚性细胞的分化和发育。4.成功构建了Y35体细胞胚原胚团阶段和成熟阶段的差异表达基因文库（A库和B库）,获得了868个差异表达的UniESTs,其中原胚团阶段400个,体细胞胚成熟阶段468个。在GenBank中进行比对后,共获得功能已知的基因516个,其中原胚团阶段237个,体细胞胚成熟阶段279个;未找到匹配序列的未知基因共270个,其中原胚团阶段111个,体细胞胚成熟阶段159个;与匹配序列同源性较低或同源性较高但功能未知的未分类基因82个,其中原胚团阶段52个,体细胞胚成熟阶段30个。5.功能分析表明,868个UniESTs分别属于代谢、转录、信号转导、转运、细胞生长分裂等19类基因。功能已知的基因中代谢类基因比例最高,且以糖代谢相关基因比例最大,其次是信号转导、蛋白质合成与降解、转运、转录和储藏蛋白相关基因,细胞结构、核酸及蛋白质加工、细胞生长分裂相关基因也占有一定比例,而发育、细胞命运、能量、防御相关基因比例较低;信号转导、转录、储藏蛋白、细胞命运和发育相关基因的比例在成熟阶段明显增加,其中储藏蛋白类基因增幅最大。6.通过半定量和Real-Time PCR技术,对WRKY和MAPKK等8类25个差异表达基因在Y35体细胞胚不同发育时期的表达分析显示,转录、信号转导、细胞生长分裂、细胞命运、物质转运和多数发育调节相关基因在体细胞胚胎发生的早期或中期比较活跃,而进入子叶胚成熟后期则主要是储藏蛋白、成熟和防御相关基因大量表达。这些参与不同生理生化过程的基因在落叶松体细胞胚的不同发育时期差异表达,并呈现出相同或不同的表达模式,表明它们在不同阶段的胚胎发育中发挥调节作用。以上结果表明,落叶松体细胞胚胎发生过程涉及复杂的生化机制和分子水平上的基因表达调控,是多因子协同作用的结果。对落叶松体细胞胚胎发生调控机理的研究,不仅为体细胞胚发生技术在林木上的进一步应用奠定了基础,也为解决生命科学问题提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 植物体细胞胚胎发生的研究现状
• 1.2.1 针叶树体细胞胚胎的发生
• 1.2.2 植物体细胞胚胎发生的生理生化基础
• 1.2.3 植物体细胞胚胎发生过程中相关应答基因的研究概况
• 1.3 差异表达基因的研究方法
• 1.3.1 m RNA 差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.3.2 cDNA 差示分析或代表性差异分析（cDNA-RDA）
• 1.3.3 基因表达系列分析（SAGE）
• 1.3.4 cDNA-AFLP 技术
• 1.3.5 抑制性消减杂交（SSH）
• 1.4 研究目标和主要研究内容
• 1.4.1 研究目标
• 1.4.2 主要研究内容
• 1.5 研究技术路线
• 第二章 落叶松体细胞胚不同发育时期的形态变化及生化差异
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂及配制方法
• 2.1.3 落叶松体细胞胚发生过程中的形态学观察
• 2.1.4 落叶松体细胞胚发生过程中几种生化指标的测定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 落叶松体细胞胚胎发生过程中的形态变化
• 2.2.2 落叶松体细胞胚胎不同发育时期生化指标测定结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 可溶性蛋白与落叶松体细胞胚胎发生的关系
• 2.3.2 可溶性糖和淀粉与落叶松体细胞胚胎发生的关系
• 2.3.3 抗氧化酶类与落叶松体细胞胚胎发生的关系
• 2.4 小结
• 第三章 落叶松体细胞胚原胚团阶段和成熟阶段差异表达基因文库的构建与诠释
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 总RNA 提取
• 3.1.5 mRNA 分离纯化
• 3.1.6 消减文库的构建
• 3.1.7 消减文库的克隆
• 3.1.8 插入片段的PCR 鉴定
• 3.1.9 阳性克隆的测序和序列分析
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 总RNA 的提取与mRNA 的纯化
• 3.2.2 双链cDNA 的合成和RsaⅠ酶切
• 3.2.3 接头连接效率分析
• 3.2.4 两轮PCR 扩增
• 3.2.5 消减效率的分析
• 3.2.6 差异表达cDNA 片段的克隆和PCR 鉴定
• 3.2.7 阳性克隆的cDNA 测序
• 3.2.8 消减文库的生物信息学诠释及功能分类
• 3.3 讨论
• 3.3.1 各类差异表达基因在落叶松体细胞胚胎不同发育阶段的分布
• 3.3.2 不同功能的基因在落叶松体细胞胚胎发生过程中的作用
• 3.4 小结
• 第四章 部分ESTs 在落叶松体细胞胚不同发育时期的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 总RNA 提取
• 4.1.3 cDNA 第一链的合成
• 4.1.4 部分差异表达基因的表达分析
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 部分差异表达基因的半定量PCR 分析
• 4.2.2 部分差异表达基因的定量PCR 分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 部分转录相关基因对落叶松体细胞胚胎发生的调控
• 4.3.2 部分信号转导相关基因对落叶松体细胞胚胎发生的调控
• 4.3.3 部分细胞生长分裂相关基因对落叶松体细胞胚胎发生的调控
• 4.3.4 部分发育相关基因对落叶松体细胞胚胎发生的调控
• 4.3.5 其它类型基因对落叶松体细胞胚胎发生的调控
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论与展望
• 参考文献
• 缩写
• A 库UniESTs 序列比对结果
• 在读期间的学术研究
• 致谢