本文主要研究内容
作者张铭琪（2019）在《miR-454在牛乳腺上皮细胞中靶向PPAR-γ对甘油三酯合成的影响及其机制研究》一文中研究指出：MicroRNAs是一类在动植物体内广泛表达的微小RNA分子,是调节基因表达的重要因子,通常在转录后水平发挥其调控作用。它能够通过识别并特异性结合其靶基因的3’-UTR来阻断翻译过程或者降解mRNA,从而实现调控作用。PPARs属于配体诱导核受体,在细胞内广泛参与许多代谢途径。PPAR-γ是其中的一员,是重要的细胞转录因子,又与脂质代谢有着密不可分的关系。PPAR-γ基因是奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯合成基因网络中的关键一环,其表达水平与细胞的甘油三酯合成量呈正相关,且甘油三酯是乳脂的主要成分。因此,PPAR-γ基因被我们选定为重点关注的靶基因。使用TargetScan预测可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNAs,共预测出69个可能靶向作用于PPAR-γ基因的miRNA。除去已证实存在靶向调控关系的miRNA,结合评分,我们选取了miR-454与miR-27b作为候选miRNAs。利用双荧光素酶报告检测miRNA和靶基因的互作关系。将牛的PPAR-γ基因的mRNA的全长3’UTR区克隆到双荧光素酶载体中的XhoI和NotI位点之间,产物长度为118bp。以TargetScan预测的miR-454和miR-27b的结合位点为依据构建突变型载体:突变I型载体(bos-PPARG–MUT1)突变为:AACGTGA,突变II型载体(bos-PPARG–MUT1)突变为:TGACACT。载体构建完成后,将其与miRNA mimics共转染入293T细胞。双荧光素酶活性报告显示,与对照组相比,miR-454的过表达使双荧光活性降低超过40%,显著低于对照组的荧光活性(p<0.05)。随着其预测靶位点的突变,miR-454的过表达使293T细胞中的荧光素酶活性显著增加且与对照组(NC)相比无明显变化(p>0.05);然而,与NC组相比,miR-27b的过表达使荧光活性下降不超过30%。结合以上实验结果可知,miR-454能直接结合PPAR-γ基因的3’UTR,表明miR-454可以调控PPAR-γ基因的表达,而miR-27b则无法通过预测位点靶向调控PPAR-γ基因的表达。为进一步探究miR-454对PPAR-γ基因的调控作用模式,将miR-454 mimics和miR-454 inhibitor转染到细胞中。荧光定量PCR结果显示,转染miR-454 mimics48h后,与对照组相比miR-454的表达量显著上升(p<0.05);而转染miR-454inhibitor后,与对照组相比miR-454的表达量显著下降(p<0.05)。结果表明成功过表达或干扰奶牛乳腺上皮细胞内的miR-454。对目的基因的荧光定量PCR结果显示,转染miR-454 mimics 48h后,与NC组相比PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著下降(p<0.05),而转染了miR-454 inhibitor后,与I-NC相比PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著上升(p<0.05)。结果表明通过对miR-454的过表达,PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著降低,而干扰miR-454的表达,使PPAR-γ基因的mRNA表达水平显著上升。对Western Blot的显影图像结果进行灰度分析,结果显示:转染miR-454 mimics 48h后,与NC组相比转染miR-454 mimics使PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著下降(p<0.05),而与I-NC相比转染miR-454inhibitor使PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著上升(p<0.05)。结果表明通过对miR-454的过表达,PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著降低;而干扰miR-454的表达,PPAR-γ基因的蛋白表达水平显著上升。该实验结果进一步确认了miR-454靶向作用于PPAR-γ基因,并有可能通过调控PPAR-γ基因的表达量影响甘油三酯合成。为了探究miR-454对甘油三酯合成的影响,将转染48 h后的奶牛乳腺上皮细胞进行油红O染色和细胞总甘油三酯测定。结果观察到过表达miR-454降低了脂滴的积累和甘油三酯的产生;而miR-454的抑制出现了相反的结果。因此,证实了miR-454可通过调控PPAR-γ基因的表达水平来影响乳脂合成。对PPAR-γ基因的下游基因的研究发现,转染miR-454 mimics 48 h后,与NC组相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平显著下降(p<0.05),而转染miR-454 inhibitor后,与I-NC相比FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平显著上升(p<0.05)。miR-454的过表达和干扰还能影响PPAR-γ基因下游的FABP3基因和PLIN2基因的mRNA表达水平,从而参与甘油三酯的合成途径。研究结果验证了miR-454是PPAR-γ基因的调控因子,miR-454能够通过调控PPAR-γ基因及下游基因的表达来影响甘油三酯的合成。本研究结果为优良品系奶牛选育提供了理论依据,也为乳脂代谢过程的研究提供了新的思路。
Abstract
MicroRNAsshi yi lei zai dong zhi wu ti nei an fan biao da de wei xiao RNAfen zi ,shi diao jie ji yin biao da de chong yao yin zi ,tong chang zai zhuai lu hou shui ping fa hui ji diao kong zuo yong 。ta neng gou tong guo shi bie bing te yi xing jie ge ji ba ji yin de 3’-UTRlai zu duan fan yi guo cheng huo zhe jiang jie mRNA,cong er shi xian diao kong zuo yong 。PPARsshu yu pei ti you dao he shou ti ,zai xi bao nei an fan can yu hu duo dai xie tu jing 。PPAR-γshi ji zhong de yi yuan ,shi chong yao de xi bao zhuai lu yin zi ,you yu zhi zhi dai xie you zhao mi bu ke fen de guan ji 。PPAR-γji yin shi nai niu ru xian shang pi xi bao zhong gan you san zhi ge cheng ji yin wang lao zhong de guan jian yi huan ,ji biao da shui ping yu xi bao de gan you san zhi ge cheng liang cheng zheng xiang guan ,ju gan you san zhi shi ru zhi de zhu yao cheng fen 。yin ci ,PPAR-γji yin bei wo men shua ding wei chong dian guan zhu de ba ji yin 。shi yong TargetScanyu ce ke neng ba xiang zuo yong yu PPAR-γji yin de miRNAs,gong yu ce chu 69ge ke neng ba xiang zuo yong yu PPAR-γji yin de miRNA。chu qu yi zheng shi cun zai ba xiang diao kong guan ji de miRNA,jie ge ping fen ,wo men shua qu le miR-454yu miR-27bzuo wei hou shua miRNAs。li yong shuang ying guang su mei bao gao jian ce miRNAhe ba ji yin de hu zuo guan ji 。jiang niu de PPAR-γji yin de mRNAde quan chang 3’UTRou ke long dao shuang ying guang su mei zai ti zhong de XhoIhe NotIwei dian zhi jian ,chan wu chang du wei 118bp。yi TargetScanyu ce de miR-454he miR-27bde jie ge wei dian wei yi ju gou jian tu bian xing zai ti :tu bian Ixing zai ti (bos-PPARG–MUT1)tu bian wei :AACGTGA,tu bian IIxing zai ti (bos-PPARG–MUT1)tu bian wei :TGACACT。zai ti gou jian wan cheng hou ,jiang ji yu miRNA mimicsgong zhuai ran ru 293Txi bao 。shuang ying guang su mei huo xing bao gao xian shi ,yu dui zhao zu xiang bi ,miR-454de guo biao da shi shuang ying guang huo xing jiang di chao guo 40%,xian zhe di yu dui zhao zu de ying guang huo xing (p<0.05)。sui zhao ji yu ce ba wei dian de tu bian ,miR-454de guo biao da shi 293Txi bao zhong de ying guang su mei huo xing xian zhe zeng jia ju yu dui zhao zu (NC)xiang bi mo ming xian bian hua (p>0.05);ran er ,yu NCzu xiang bi ,miR-27bde guo biao da shi ying guang huo xing xia jiang bu chao guo 30%。jie ge yi shang shi yan jie guo ke zhi ,miR-454neng zhi jie jie ge PPAR-γji yin de 3’UTR,biao ming miR-454ke yi diao kong PPAR-γji yin de biao da ,er miR-27bze mo fa tong guo yu ce wei dian ba xiang diao kong PPAR-γji yin de biao da 。wei jin yi bu tan jiu miR-454dui PPAR-γji yin de diao kong zuo yong mo shi ,jiang miR-454 mimicshe miR-454 inhibitorzhuai ran dao xi bao zhong 。ying guang ding liang PCRjie guo xian shi ,zhuai ran miR-454 mimics48hhou ,yu dui zhao zu xiang bi miR-454de biao da liang xian zhe shang sheng (p<0.05);er zhuai ran miR-454inhibitorhou ,yu dui zhao zu xiang bi miR-454de biao da liang xian zhe xia jiang (p<0.05)。jie guo biao ming cheng gong guo biao da huo gan rao nai niu ru xian shang pi xi bao nei de miR-454。dui mu de ji yin de ying guang ding liang PCRjie guo xian shi ,zhuai ran miR-454 mimics 48hhou ,yu NCzu xiang bi PPAR-γji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe xia jiang (p<0.05),er zhuai ran le miR-454 inhibitorhou ,yu I-NCxiang bi PPAR-γji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe shang sheng (p<0.05)。jie guo biao ming tong guo dui miR-454de guo biao da ,PPAR-γji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe jiang di ,er gan rao miR-454de biao da ,shi PPAR-γji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe shang sheng 。dui Western Blotde xian ying tu xiang jie guo jin hang hui du fen xi ,jie guo xian shi :zhuai ran miR-454 mimics 48hhou ,yu NCzu xiang bi zhuai ran miR-454 mimicsshi PPAR-γji yin de dan bai biao da shui ping xian zhe xia jiang (p<0.05),er yu I-NCxiang bi zhuai ran miR-454inhibitorshi PPAR-γji yin de dan bai biao da shui ping xian zhe shang sheng (p<0.05)。jie guo biao ming tong guo dui miR-454de guo biao da ,PPAR-γji yin de dan bai biao da shui ping xian zhe jiang di ;er gan rao miR-454de biao da ,PPAR-γji yin de dan bai biao da shui ping xian zhe shang sheng 。gai shi yan jie guo jin yi bu que ren le miR-454ba xiang zuo yong yu PPAR-γji yin ,bing you ke neng tong guo diao kong PPAR-γji yin de biao da liang ying xiang gan you san zhi ge cheng 。wei le tan jiu miR-454dui gan you san zhi ge cheng de ying xiang ,jiang zhuai ran 48 hhou de nai niu ru xian shang pi xi bao jin hang you gong Oran se he xi bao zong gan you san zhi ce ding 。jie guo guan cha dao guo biao da miR-454jiang di le zhi di de ji lei he gan you san zhi de chan sheng ;er miR-454de yi zhi chu xian le xiang fan de jie guo 。yin ci ,zheng shi le miR-454ke tong guo diao kong PPAR-γji yin de biao da shui ping lai ying xiang ru zhi ge cheng 。dui PPAR-γji yin de xia you ji yin de yan jiu fa xian ,zhuai ran miR-454 mimics 48 hhou ,yu NCzu xiang bi FABP3ji yin he PLIN2ji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe xia jiang (p<0.05),er zhuai ran miR-454 inhibitorhou ,yu I-NCxiang bi FABP3ji yin he PLIN2ji yin de mRNAbiao da shui ping xian zhe shang sheng (p<0.05)。miR-454de guo biao da he gan rao hai neng ying xiang PPAR-γji yin xia you de FABP3ji yin he PLIN2ji yin de mRNAbiao da shui ping ,cong er can yu gan you san zhi de ge cheng tu jing 。yan jiu jie guo yan zheng le miR-454shi PPAR-γji yin de diao kong yin zi ,miR-454neng gou tong guo diao kong PPAR-γji yin ji xia you ji yin de biao da lai ying xiang gan you san zhi de ge cheng 。ben yan jiu jie guo wei you liang pin ji nai niu shua yo di gong le li lun yi ju ,ye wei ru zhi dai xie guo cheng de yan jiu di gong le xin de sai lu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自吉林大学的张铭琪，发表于刊物吉林大学2019-06-25论文，是一篇关于奶牛乳腺上皮细胞论文,甘油三酯论文,吉林大学2019-06-25论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自吉林大学2019-06-25论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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