人工分子伴侣体系辅助溶菌酶复性的研究

论文摘要

如何对包含体蛋白进行正确的体外折叠,以期能够获得高浓度、高收率的活性蛋白产品是蛋白质工业化应用的瓶颈。为此本文对模型蛋白溶菌酶进行了研究。首先考察了盐酸胍、DTT、变性时间对变性过程中自由巯基数、残余活力及稀释复性率三个参数的影响。当溶菌酶浓度为15mg/mL时得出变性条件是6M盐酸胍,5mM DTT, 在36℃及100 rpm摇床中60min能够彻底还原变性,且复性效果最好。复性液中DTT的存在对复性效果没有影响。接着研究了去污剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和β-环糊精（β-CD）的人工分子伴侣体系对变性-还原溶菌酶的氧化复性效果。相继考察了各种因素对复性率的影响。结果发现,溶菌酶最佳的复性操作条件为:pH值8. 1,半胱氨酸作二硫键重排剂,浓度为1-2mM,CTAB与β-CD的最佳的复性浓度分别为0. 6-1. 2mM和30mg/1. 5mL。此外复性率随酶浓度的升高有所降低。最后,在β环糊精的基础上合成了固态环糊精β-CDP,其大小在50-200μm之间,呈无色透明状。β-CDP对溶菌酶的复性效果由于受到固液传质的影响,对于溶菌酶浓度为50pμg/mL时只达到40%的复性率,但重复利用率较好。为人工分子伴侣的固定化研究和复性应用打下了基础。

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Abstract

第一章文献综述

1. 1 蛋白质复性的必要性

1. 1. 1 包含体的形成

1. 1. 2 包含体的处理

1. 2 蛋白质折叠复性

1. 2. 1 蛋白质折叠复性机理及理论

1. 2. 2 蛋白质体外折叠复性方法

1. 2. 2. 1 透析和稀释复性法

1. 2. 2. 2 折叠添加剂辅助复性

1. 2. 2. 3. 反相微团复性法

1. 2. 2. 4 双水相法复性

1. 2. 2. 5 色谱复性技术

1. 2. 2. 6 结合分子生物学复性法

1. 2. 3 蛋白质复性过程的检测方法

1. 3 人工分子伴侣

1. 3. 1 分子伴侣简介

1. 3. 2 人工分子伴侣的提出

1. 3. 3 环糊精简介

1. 3. 4 人工分子伴侣的研究及固定化技术的应用

1. 4 本论文的研究意义及内容

第二章溶菌酶变性条件的优化

2. 1 溶菌酶简介

2. 2 实验仪器及材料

2. 2. 1 试剂

2. 2. 2 设备

2. 3 分析实验方法

2. 3. 1 溶菌酶活性测定

2. 3. 2 溶菌酶自由巯基含量测定-DTNB法

2. 3. 3 蛋白质含量的测定--考马斯亮蓝法

2. 3. 4 溶菌酶的变性

2 . 3 . 5溶菌酶稀释复性

2. 4 结果与讨论

2. 4. 1 盐酸胍对溶菌酶的变性作用

2. 4. 2 DTT浓度对变性溶菌酶还原作用的影响

2. 4. 3 DTT对溶菌酶稀释复性过程的影响

2. 4. 4 高酶浓度所需DTT浓度的确定

2. 4. 5 变性时间对酶活及自由巯基数的影响

2. 4. 6 变性时间对酶稀释复性的影响

2. 5 本章小结

第三章人工分子伴侣辅助溶菌酶复性

3. 1 实验材料及仪器

3. 1. 1 试剂

3. 1. 2 设备

3. 2 分析实验方法

3. 2. 1 溶菌酶的变性

3. 2. 2 溶菌酶折叠中间体稳定性测定

3. 2. 3 溶菌酶复性

3. 2. 4 溶菌酶活性测定

3. 2. 5 紫外光谱扫描分析折叠蛋白质

3. 2. 6 SDS-PAGE电泳

3. 3 实验结果与讨论

3. 3. 1 人工分子伴侣辅助变性溶菌酶复性

3. 3. 2 去污剂种类的影响

3. 3. 3 去污剂和环糊精浓度对复性的影响

3. 3. 4 β-CD加入时间的影响

3. 3. 5 二硫键重排剂对复性效果的影响

3. 3. 6 pH值的影响

3. 3. 7 溶菌酶浓度的影响

3. 3. 8 再折叠溶菌酶的结构特性分析

3. 4 小结

第四章固化环糊精辅助溶菌酶复性

4. 1 实验材料及仪器

4. 1. 1 试剂

4. 1. 2 设备

4. 2 实验分析方法

4. 2. 1 溶菌酶的变性

4. 2. 2 溶菌酶复性

4. 2. 3 固化环糊精的制备

4. 3 实验结果与讨论

4. 3. 1 固化环糊精的表征

4. 3. 2 固化环糊精辅助复性

4. 3. 3 颗粒大小对复性的影响

4. 3. 4 β-CD／β-CDP比例对复性的影响

4. 4 小结

第五章结论与建议

5. 1 结论

5. 2 建议

参考文献

致谢

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