VB12发酵工艺及其菌株的遗传改造

论文摘要

VB12又称钴胺素,是含有钴的咕啉类化合物的总称,是唯一一种含金属离子的维生素。VB12作为人体组织代谢过程中必须的维生素,它对维持人体和其它哺乳动物的红细胞生长非常重要,临床上主要用于治疗恶性贫血和神经系统疾病。它被广泛应用于医药、保健品和饲料添加剂等领域,市场上对其需求量逐年增加。目前,VB12的生产有两种发酵工艺,一种是以丙酸菌（Propionibacterium）为代表的厌氧发酵工艺;另一种是以脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）为代表的好氧发酵工艺,比较两种工艺,厌氧发酵工艺具有质量优势,好氧发酵工艺具有产量优势。本论文选用谢氏丙酸菌,对其厌氧发酵产生VB12工艺和菌株的遗传改造进行了研究。（1）本文选取了六株丙酸菌（27、30、31、PX、pff和W-T）,对其发酵过程丙乙酸产生、葡萄糖消耗和细胞生长以及VB12的合成情况进行了对比研究,结果表明W-T菌株的发酵性能最优,后续实验均选用W-T作为出发菌株。（2）对W-T菌株进行了发酵工艺优化,通过对葡萄糖、玉米浆、BY的需求,以及最适pH值和最佳加入前体物质DMBI时间的研究。发现葡萄糖和玉米浆促进VB12产量由42.46mg/l提高到了55.74mg/l,提高了31.28%;单因子BY在细胞菌体量不增加的情况下,促使VB12产量提高到了60.71mg/l,提高了9.76%。（3）采用厌氧罐抽真空和充氮气两种方法,创建了高通量筛选的丙酸菌厌氧平板单克隆技术。（4）从VB12高产菌株W-T和低产菌株pff出发,分别PCR扩增了其CobA基因,通过对序列分析,结果表明两株菌CobA基因的序列完全相同。（5）为了构建丙酸菌分子操作技术系统,我们研究了丙酸菌对三种抗生素的敏感性。结果表明,在实验浓度范围内（25 ppm～100 ppm）,氯霉素和四环素对丙酸菌都有生长抑制作用,氯霉素的抑制作用更为突出,潮霉素没有抑制作用。为建立丙酸菌转化子筛选标记打下了良好的基础。（6）首次构建了含有氯霉素抗性基因的丙酸菌同源基因重组片段,通过电转化,转入丙酸菌内,并筛选到了具有抗氯霉素抗性的转化子,检测了转化子VB12的生物合成产量。结果,获得了产量明显降低的M6、M7负突变菌株,两株菌微生物学特征不明显,VB12生物合成量分别降低了13.69%,17.55%,但没有发现产量明显提高的正转化子。综上所述,本文的主要创新点:（1）建立了丙酸菌的单克隆厌氧培养方法。（2）优化了VB12的发酵工艺,发现了葡萄糖和玉米浆促进VB12产量提高了31.28%,并且促进剂BY对VB12具有增产作用,使VB12的产量提高了9.76%。（3）首次创建了丙酸菌的遗传转化操作体系,获得了抗氯霉素的转化子,为进一步寻找调控VB12产量合成的关键基因奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 12 的结构特征及其分类'>1.1 VB₁₂的结构特征及其分类
• 12 的理化性质'>1.2 VB₁₂的理化性质
• 12 的应用及生物学功能'>1.3 VB₁₂的应用及生物学功能
• 12 的生物合成途径与代谢'>1.4 VB₁₂的生物合成途径与代谢
• 12 的生产菌株'>1.5 VB₁₂的生产菌株
• 12 的生产菌种'>1.5.1 VB₁₂的生产菌种
• 1.5.2 丙酸菌的形态生理特性
• 1.5.3 丙酸菌的育种技术
• 1.6 抗生素对微生物的筛选
• 12 的国内外发酵水平'>1.7 微生物合成VB₁₂的国内外发酵水平
• 12 的发展前景'>1.8 VB₁₂的发展前景
• 1.9 课题研究的意义与主要研究目的
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 其它仪器
• 2.1.4 实验试剂
• 2.1.5 其它实验试剂
• 2.1.6 培养基
• 2.1.7 实验试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌体培养流程
• 2.2.2 菌体湿重的测定
• 2.2.3 残糖的测定
• 12 含量'>2.2.4 高效液相色谱仪测VB₁₂含量
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳操作步骤
• 2.2.6 对已有的不同菌株进行对比筛选
• 12 生物合成发酵培养基的初步优化'>2.2.7 VB₁₂生物合成发酵培养基的初步优化
• 2.2.8 对菌株进行遗传操作
• 12 的发酵学研究'>2.2.9 突变株合成VB₁₂的发酵学研究
• 第3章 实验内容与结果
• 3.1 不同丙酸菌的生理研究及其筛选
• 3.1.1 六株丙酸菌的个体形态
• 3.1.2 六株丙酸菌的菌悬液
• 3.1.3 六株丙酸生长情况
• 3.2 丙酸杆菌发酵工艺优化结果
• 3.2.1 培养基中葡萄糖量的影响
• 3.2.2 培养基中玉米浆的影响
• 3.2.3 玉米浆与葡萄糖共同影响
• 12 增效因子的筛选'>3.2.4 VB₁₂增效因子的筛选
• 3.2.5 培养基pH 的影响
• 3.2.6 DMBI 加入时间的影响
• 3.3 单克隆的培养
• 3.3.1 多孔板涂布培养单菌落
• 3.3.2 厌氧罐固体涂布培养单菌落
• 3.3.3 夹层培养单克隆
• 3.3.4 反复充氮气法培养单克隆
• 12 相关基因的扩增'>3.4 丙酸菌基因组提取及VB₁₂相关基因的扩增
• 3.4.1 丙酸菌基因组DNA 的提取
• 3.4.2 对W-T 和pff 的基因组进行对比
• 3.5 丙酸菌对抗生素敏感研究
• 3.5.1 不同浓度的氯霉素对丙酸菌生长的影响
• 3.5.2 不同浓度的潮霉素对丙酸菌的影响
• 3.5.3 不同浓度的四环素对丙酸菌的影响
• 3.6 丙酸菌菌株的遗传改造
• 3.6.1 大肠质粒的提取以及PCR 克隆大肠质粒[56]
• 3.6.2 PCR 产物纯化回收
• 3.6.3 电激转化结果
• 3.6.4 转化子鉴定
• 12 的发酵学研究'>3.6.5 突变株合成VB₁₂的发酵学研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢