论文摘要
目的:炎性介质如细胞因子,类花生四烯酸类物质和生长因子在起动和维持肿瘤细胞的存活和生长过程中起重要作用,这些介质中,PGE2可以由肿瘤产生。PGE2在催化酶COX-1和COX-2的催化下由花生四烯酸转变而成。COX-1持续表达于大部分正常组织,而COX-2由炎性细胞和人类肿瘤的细胞因子和肿瘤诱导剂诱导生成。环氧化酶可被传统的非甾体抗炎药抑制活性,如阿司匹林,吲哚美辛等。COX-2对肿瘤的生物学行为有显著的影响,可作用于多种肿瘤类型。其参与了肿瘤生成的多个环节,COX-2抑制剂一个可能的抗肿瘤机制是其抑制了新生血管的生成,另外还可能调控细胞因子合成,影响细胞增殖和凋亡,调控核转录和肿瘤抑制基因产物的功能。在西方国家,结直肠癌已上升为恶性肿瘤的第二位死因,在我国发病率和死亡率不断上升。流行病学研究显示使用非甾体抗炎药使人类结直肠癌死亡率较下降40-50%,提示抑制环氧化酶活性可起到肿瘤的化学预防作用,抑制环氧化酶活性可抑制结肠癌生成。因此环氧化酶活性在肿瘤的生成中起重要作用。肿瘤生成和发展是一个复杂的过程,虽然COX-2可用现有药物抑制,只依赖COX-2抑制剂不可能对肿瘤产生致死性的影响,因此,联合应用COX-2抑制剂和化疗药物可能同时产生细胞毒作用和抗血管生成效应,或者克服多药耐药性而促进抗肿瘤效果。生存素（survivin）是Wnt信号传导通路中阻碍细胞死亡和控制有丝分裂的基因。在正常成人不能检测到,在几乎所有的人类肿瘤中显著表达。非甾体抗炎药在体外可通过抑制Wnt信号通路降低survivin的表达,但体内研究未见报道。奥沙利铂与其它抗癌药物如氟脲嘧啶和亚叶酸钙一起用于治疗失败后的结直肠癌转移的患者。本实验通过建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,以选择性COX-2抑制剂塞来昔布（celecoxib）和奥沙利铂（oxaliplatin）对裸鼠结肠癌模型分组进行干预治疗,研究不同剂量塞来昔布对人结肠癌裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡、survivin表达和微血管生成的影响及其联合应用奥沙利铂可能产生的协同作用。方法:1将人结肠癌HT-29细胞注射于裸鼠背部皮下建立移植瘤模型,16天后,将裸鼠随机分为五组:对照组、塞来昔布一组（25mg/kg/d）、塞来昔布二组（50mg/kg/d）、塞来昔布三组（75mg/kg/d）、塞来昔布四组（100mg/kg/d）,并给予相应剂量的塞来昔布。每周测量肿瘤体积,给药35天后,处死裸鼠,切取移植瘤组织检测COX-2,suvivin蛋白表达,VEGF mRNA表达,细胞凋亡和微血管密度（MVD）。2将人结肠癌HT-29细胞注射于裸鼠背部皮下建立移植瘤模型,16天后,将裸鼠随机分为四组:对照组;奥沙利铂组;塞来昔布组;奥沙利铂联合塞来昔布组。并给予相应的药物。每周测量肿瘤体积,给药35天后,处死裸鼠,切取移植瘤组织检测COX-2,VEGF mRNA和微血管密度（MVD）。3用免疫组织化学方法检测64例结直肠癌组织中COX-2的表达,微血管形成及淋巴管生成,分析其相关性及与临床病理参数联系。临床晚期直肠癌患者7例,给予塞来昔布灌肠治疗15天,对活检肿瘤组织微血管及淋巴管密度进行对比。结果:1 50只裸鼠均成瘤,成瘤率100%,成瘤时间为细胞种植后第5-11天。肿瘤细胞种植后第16天,肿瘤直径平均达5mm。在实验后期,塞来昔布三组和四组裸鼠活动较其它三组明显减少,精神状态差,三组和四组各有二只裸鼠死亡。实验结束切取瘤组织后,对裸鼠解剖各组均未发现移植瘤肝转移。治疗结束后,各组移植瘤体积分别为:对照组1326±238mm3;塞来昔布一组923±171mm3;塞来昔布二组863±177mm3;塞来昔布三组729±179mm3;塞来昔布四组647±205mm3。不同剂量塞来昔布均能明显抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长。塞来昔布一、二、三、四组抑瘤率分别为34.94%; 39.20%;53.50%; 59.20%。方差分析组间比较显示,与对照组比较,塞来昔布一、二、三和四组移植瘤生长缓慢（分别P<0.05）。塞来昔布四组移植瘤较塞来昔布一组生长缓慢（P<0.05）,其余各组之间比较抑瘤率无明显差异（P>0.05）。对COX-2免疫组织化学染色切片进行积分光密度测定,方差分析两两比较结果显示,与对照组比较,塞来昔布各组COX-2表达水平均明显降低,（分别P<0.05）;与塞来昔布一组比较,塞来昔布三、四组COX-2表达水平明显降低（分别P<0.05）。塞来昔布一组和二组之间比较、塞来昔布二、三、四组之间比较,COX-2表达水平无差别。对survivin的免疫组织化学染色切片进行光密度值测定,进行方差分析,两两比较显示,与对照组相比,塞来昔布各组survivin表达水平均明显降低（分别P<0.05）;与塞来昔布一组比较,塞来昔布四组suvivin表达明显降低（P<0.05）;其余各组之间survivin表达差别无统计学意义（P>0.05）。将RT-PCR产物经电泳分析,加入VEGF-mRNA引物的各组均可见约173bp的扩增带,加入GAPDH引物的各组均可见238bp的扩增带,对各条带进行灰度分析发现,塞来昔布各组VEGF-mRNA表达低于对照组,差别有统计学意义（分别P<0.05）,塞来昔布各用药组之间VEGF-mRNA表达差别无统计学意义（P>0.05）。免疫组织化学染色后对微血管热区进行计数,方差分析两两比较结果显示,塞来昔布用药各组MVD值均较对照组降低,差别有统计学意义（分别P<0.05）。塞来昔布一、二、三、四组之间比较,MVD无显著性差别（P>0.05）。对TUNEL染色切片进行观察,计算凋亡指数。对照组,塞来昔布一组,二组,四组的凋亡指数分别为0.46±0.20,2.72±1.15,2.82±1.07,3.91±1.12。与对照组比较,塞来昔布给药各组肿瘤组织细胞凋亡明显增加（分别P<0.05）。塞来昔布四组移植瘤细胞凋亡较塞来昔布一组和二组高（分别P<0.05）,其余各组之间比较凋亡指数无明显差异（P>0.05）。2 42只裸鼠均成瘤,成瘤率100%,成瘤时间为细胞种植后第5-11天。肿瘤细胞种植后第16天,肿瘤直径平均达5mm。成瘤后早期裸鼠的体重,活动情况没有明显改变,随着肿瘤形成并逐渐增大,裸鼠逐渐出现消瘦,活动减少。奥沙利铂组有1只裸鼠出现腹泻,联合用药组2只和对照组1只裸鼠在实验后期出现活动减少,消瘦明显。在实验期内,所有裸鼠均未出现死亡,实验结束切取瘤组织后,对裸鼠解剖各组均未发现移植瘤肝转移。治疗结束后,各组移植瘤体积分别为:对照组1326±238mm3;塞来昔布组923±171mm3;奥沙利铂组963±192mm3;联合用药组604±213mm3。塞来昔布和化疗药物奥沙利铂均能明显抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长,肿瘤生长缓慢。塞来昔布和化疗药物奥沙利铂抑瘤率分别为34.94%和30.53%;两者联用抑瘤率明显增加,达62.87%。方差分析组间比较显示,与对照组比较,塞来昔布组、奥沙利铂组和联合用药组移植瘤生长缓慢,差别有统计学意义（分别P<0.05）。联合用药较塞来昔布和奥沙利铂单用抑瘤率明显增加（分别P<0.05）。塞来昔布和奥沙利铂对移植瘤生长抑制作用无明显差异（P>0.05）。对COX-2免疫组织化学染色切片进行积分光密度测定,方差分析显示,奥沙利铂组COX-2表达高于对照组,差别有统计学意义（P<0.05）;塞来昔布组和联合用药组COX-2表达水平低于对照组,差别有统计学意义（分别P<0.05）;塞来昔布组COX-2水平低于联合用药组,差别有统计学意义（P<0.05）。将RT PCR产物经电泳分析,加入VEGF引物的各组均可见约173bp的扩增带,加入GAPDH引物的各组均可见238bp的扩增带,对各条带进行灰度分析发现,奥沙利铂组VEGF高于对照组,差别有统计学意义（P<0.05）,塞来昔布组和联合用药组VEGF表达低于对照组,差别有统计学意义（P<0.05）,塞来昔布与联合用药组之间差别无统计学意义（P>0.05）。以鼠抗人CD34单克隆抗体染色微血管后对微血管热区进行计数,方差分析结果,F=6.93,P=0.0008。两两比较结果显示,奥沙利铂组与对照组比较,MVD无显著性差别（P>0.05）,塞来昔布组和联合用药组MVD值均较对照组和奥沙利铂组降低,差别有统计学意义（分别P<0.05）。3 COX-2阳性染色主要位于细胞胞浆,呈棕黄色弥漫性分布。78.13% （50/64）的结直肠癌组织COX-2高表达,14例低表达;对COX-2表达与肿瘤临床病理特征进行分析显示:Dukes C期结直肠癌组织中COX-2表达强度明显高于Dukes A和B期结直肠癌组织中COX-2的表达强度（P =0.003）;以结直肠癌的组织学类型区分,粘液腺癌组织COX-2的表达强度明显低于腺癌组织的COX-2表达强度（P =0.004）;而COX-2的表达强度与结直肠癌的分化程度、浸润深度和直径等无关。对COX-2高表达组与低表达组的MVD和LVD进行比较,COX-2高表达组MVD值明显高于COX-2低表达组（P =0.033）,COX-2高表达组LVD值明显高于COX-2低表达组（P =0.043）。对7例晚期直肠癌患者行塞来昔布灌肠治疗,治疗后直肠癌微血管密度较治疗前降低（P=0.03）,直肠癌淋巴管密度治疗前后无差别（P=0.20）。结论:1不同剂量的塞来昔布均能明显抑制结肠癌移植瘤的生长,其抑制作用呈明显的用药剂量依赖性,这种作用可能是通过抑制survivin的表达实现的。低剂量塞来昔布可抑制人结肠癌裸鼠移植瘤微血管生成,可能对防止肿瘤转移起到重要作用。2塞来昔布单独应用或联合奥沙利铂可抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长和肿瘤血管生成。塞来昔布通过在不同途径与奥沙利铂的协同作用增加了奥沙利铂的抗肿瘤效果。塞来昔布和奥沙利铂联合应用可能通过增加抗微血管生成效果降低结肠癌转移的可能性。3 COX-2可能通过促进淋巴管及微血管生成参与了结直肠癌的发生与发展。COX-2抑制剂塞来昔布可抑制直肠癌微血管生成。
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