分别作用于hTERT和ATP6L的RNA干扰对肝癌细胞生长和转移的抑制作用

论文题目: 分别作用于hTERT和ATP6L的RNA干扰对肝癌细胞生长和转移的抑制作用

论文类型: 博士论文

论文专业: 农产品加工及贮藏工程

作者: 卢小东

导师: 杨胜利,覃文新,王文兵

关键词: 干扰,肝癌,端粒酶,增殖,转移

文献来源: 江苏大学

发表年度: 2005

论文摘要: 肿瘤细胞的两大特征是无限增殖和侵袭转移。端粒酶异常活跃是细胞永生化的重要原因,因此成为抑瘤靶点。肿瘤细胞的侵袭转移与细胞外基质的分解密切相关。侵袭性实体瘤细胞周围较正常细胞有较低的pH,这主要与肿瘤细胞膜上氢泵V-ATPase活性通常增高、促氢离子外排有关。酸性条件有利于蛋白水解酶激活、消化细胞外基质,从而利于细胞侵袭。本文用基于DNA质粒的RNAi干扰技术分别抑制高转移潜能的肝癌细胞株HCCLM3端粒酶亚基hTERT和V-ATPase的ATP6L亚基表达,以达到抑制肝癌细胞生长和转移的目的。构建针对hTERT靶基因的siRNA表达质粒载体,转染HCCLM3。转染后,western blot显示hTERT被抑制;TRAP和ELISA方法显示端粒酶活性降低;MTT方法显示细胞增殖减慢。构建针对ATP6L靶基因的siRNA表达质粒载体,转染HCCLM3,经G418筛选的转染细胞命名为si-A-M3。northern blot结果显示si-A-M3的ATP6L被抑制～60%。用pH敏感荧光染料BCECF/BCECF-AM结合实时荧光分光光度计方法分析细胞培养液pH（pHe）和细胞内pH（pHi）的变化,结果为:①si-A-M3培养液培养12小时后细胞泌氢较对照组减少;②si-A-M3细胞内pHi在NH4Cl诱导酸化后,去除NH4+后恢复速度明显减慢,且不能恢复到静息pHi:③用细胞内缓冲能力校正测得si-A-M3即时排氢量明显降低。上述结果提示转染细胞的V-ATPase功能被抑制。分解细胞外基质的蛋白水解酶受pH调节。V-ATPase功能被抑制影响MMP-2/9的活性。western blot结果显示si-A-M3的MMP-2表达降低,用ELISA方法和酶谱测定细胞培养上清液中MMP-2/9活性以及用FITC-标记的gelatin原位显示移植瘤细胞周围MMP-2/9活性,均发现si-A-M3的MMP-2/9活性下调。体外培养si-A-M3的侵袭实验显示si-A-M3的侵袭力明显下降;在小鼠[BalB/c（nu+/nu+）]肝原位移植瘤模型中发现si-A-M3组肝内转移率和肺转移率明显降低;si-A-M3组肝原位生长的肿瘤体积明显小于对照组。综合上述结果,HCCLM3细胞的ATP6L被抑制后,细胞侵袭转移和生长受抑制,与细胞的V-ATPase功能被抑制及其MMP-2表达和MMP-2/9活性被抑制有关。本文证实hTERT是抑制肿瘤生长的有效标靶,同时首次报道ATP6L的RNA干扰对是肿瘤转移和生长具有明显抑制作用。本文的结果为研究肿瘤发生和转移机制以及探索抑瘤方法提供了参考。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一部分 RNAi的发展与应用

1 引言

2 RNAi的发展

3 RNAi的机制

3.1 Dicer是RNAi的启动因子

3.2 RISC是RNAi的效应因子

3.3 RdRPs为RNAi扩大效应所必需

3.4 一些膜蛋白参与系统RNAi(systematic RNAi)

3.5 miRNA诱导内在的RNAi通路

4 RNAi在肿瘤转移研究中的应用

5 RNAi在其它领域的应用及发展前景

5.1 RNAi在肿瘤研究其它方面的应用

5.2 RNAi用于高通量的基因功能研究

5.3 RNAi用于应用揭示基本生命现象的机制

5.4 RNAi技术的发展趋势及应用局限

6 RNAi技术在哺乳动物系统中的应用

6.1 siRNA的设计

6.2 siRNA的生成

6.3 siRNA的导入或表达

6.4 RANi效应的检测

6.5 RNAi技术的网上资源

7 RNAi的应用实例

7.1 材料

7.2 方法

8 参考文献

第二部分 hTERT RNAi对肝癌细胞端粒酶的抑制

1 引言

2 材料和方法

2.1 转染

2.2 hTERT蛋白表达(western blot)

2.3 端粒酶活性的检测

2.4 转化细胞的生长曲线测定

3 结果

3.1 si-T-PSG质粒在HCCLM3中表达

3.2 si-T-PU6质粒对hTERT有抑制作用

3.3 si-T-PU6质粒抑制端粒酶活性

3.4 si-T-M3细胞生长受抑制

4 讨论

4.1 端粒和端粒酶

4.2 端粒酶与肿瘤

4.3 问题和展望

5 参考文献

第三部分 ATP6L对肝癌细胞转移和生长的抑制

1 引言

2 材料和方法

2.1 细胞培养和载体构建

2.2 转染

2.3 RNA抽提、RT-PCR及Northern blot

2.4 体外侵袭实验

2.5 V-ATPase功能检测

2.6 MMP-2表达及MMP-2/9活性检测

2.7 肿瘤移植模型

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 si-A-M3中ATP6L表达受抑制

3.2 si-A-M3体外侵袭力的抑制

3.3 si-A-M3细胞V-ATPase功能的抑制

3.4 si-A-M3细胞中MMP-2/9的下调

3.5 种植于小鼠肝脏的si-A-M3细胞生长受到抑制

3.6 种植于小鼠肝脏si-A-M3细胞肝内转移和肺转移均受到抑制

4 讨论

4.1 肿瘤细胞的泌酸增强——"Warburg效应"

4.2 肿瘤细胞泌酸的重要机制——V-ATPase

4.3 结语——抑制泌酸是抑制肿瘤的有效途径

5 参考文献

在读期间发表的主要论文目录

致谢

发布时间: 2009-08-11

参考文献

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