小麦Na+/H+逆转运蛋白TaNHX2的功能验证及功能域分析

论文摘要

土壤盐渍化是限制农作物产量的主要因素之一,其中Na+是土壤盐分的主要成份,而且由于不合理灌溉引起的次生盐渍化使盐渍化土壤的面积继续增加。据统计,影响作物产量的各种环境因素中,干旱和盐碱造成的减产在40%以上,因此,如何提高植物的耐盐性成为当前一个迫切需要解决的科学问题。研究表明植物耐盐的关键是维持细胞质内的低盐浓度,盐胁迫下Na+会通过非特异性离子通道进入细胞内,为了减轻Na+的危害,植物主要通过两种方式来降低细胞质中盐的浓度:一种是通过质膜上的Na+/H+逆转运蛋白将Na+排出体外,另一种方式是通过液泡膜上的Na+/H+逆转运蛋白将Na+区隔化到液泡中,从而维持细胞内的离子平衡。小麦属淡土植物,其生长受到盐胁迫的抑制,盐害直接影响着小麦生产的发展。本研究借助酵母（Saccharomyces cerevisiae）突变体,对小麦Na+/H+逆转运蛋白TaNHX2的功能及其C-末端功能域进行了分析,主要结果如下:1.生物信息学分析表明,小麦Na+/H+逆转运蛋白TaNHX2与植物NHX蛋白中ClassⅠ类的液泡膜Na+/H+逆转运蛋白AtNHX1,AtNHX2,OsNHX2的同源性较高,分别为70.17%,71.95%,71.04%,而与ClassⅡ类的核内体Na+/H+逆转运蛋白LeNHX2同源性较低,仅为26.87%。但是GFP定位结果表明,TaNHX2的位置与LeNHX2的位置相似,位于前液泡区。2.构建酵母表达载体pYES2-TaNHX2,用PEG/LiAc热击转化方法转入酵母中,通过酵母功能互补试验证实了TaNHX2基因可以部分恢复酵母盐敏感突变体AXT3K的耐盐功能,可在AP+50 mM NaCl和AP+0.5 M KCl的培养基中生长,而转空载体的对照则表现为致死。说明TaNHX2不仅有转运Na+的功能,同时也有转运K+的功能。通过对20 mM NaCl条件下酵母细胞中的Na+、K+离子含量测定,发现转TaNHX2基因的酵母细胞中Na+的含量与对照相比没有显著差异,而K+含量差异达到了显著水平,这可能是由于TaNHX2的耐盐性不单是其转运Na+,更重要的是由于K+在细胞内的积累而导致耐盐性增强。3.用荧光定量PCR的方法研究了TaNHX2基因在NaCl盐胁迫、4oC低温胁迫、ABA离子胁迫和PEG6000干旱胁迫这4种不同逆境条件下的表达情况。结果表明,在没有胁迫时,TaNHX2基因在根和叶片中都表达,说明小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因TaNHX2具有维持植物体内离子平衡的功能。在NaCl盐胁迫和ABA离子胁迫下,根中的表达量比较大,而在叶中TaNHX2几乎不表达,在低温和干旱胁迫下,叶中的表达量要高于根中的表达量,说明TaNHX2基因的表达具有组织特异性。TaNHX2基因在植物受到非生物胁迫或ABA胁迫时起到非常关键的作用,因此可以推测小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因TaNHX2在维持细胞的渗透压平衡方面同样具有重要的作用。4.为了研究TaNHX2 C-末端的作用,采用PCR的方法获得了一系列包含不同C-末端的TaNHX2突变体,通过酵母功能互补试验证实了部分TaNHX2突变体基因的功能与野生型在耐盐方面存在差异。其中转突变体基因△439aa的酵母可在AP+80 mM NaCl的培养基中生长,而全长基因TaNHX2则只能在AP+50 mM NaCl的培养基中生长,在LiCl胁迫条件下,转突变体基因△439aa的酵母在0.5 mM LiCl条件下不能生长,而其它突变体和野生型可在0.8 mM LiCl条件下正常生长。在40 mM NaCl条件下,通过对OD600的测定发现,含TaNHX2基因的酵母和含△439aa突变体基因的酵母生长没有显著差异,当外界环境为酸性时,二者的生长状况有极显著差异,说明在特定的情况下,突变体基因可显著改变转基因酵母在盐胁迫下的敏感性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 土壤盐渍化及其危害
• 1.1.1 土壤盐渍化
• 1.1.2 土壤盐渍化对植物的危害
• 1.1.2.1 渗透胁迫
• 1.1.2.2 离子胁迫
• 1.1.2.3 营养胁迫
• 1.2 植物耐盐机理
• 1.2.1 拒盐
• 1.2.2 降低细胞内的盐浓度
• +区隔化'>1.2.2.1 Na⁺区隔化
• +外排'>1.2.2.2 Na⁺外排
• 1.2.3 有机溶质或渗透保护剂的积累
• 1.2.3.1 脯氨酸
• 1.2.3.2 甜菜碱
• 1.2.3.3 多元醇
• 1.2.3.4 多胺
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• 1.3.1 SOS 调控途径
• 1.3.1.1 SOS1 基因
• 1.3.1.2 SOS2 基因
• 1.3.1.3 SOS3 基因
• 1.3.2 NHX 调控途径
• 1.3.2.1 NHX 基因的发现
• 1.3.2.2 NHX 基因的分类
• 1.3.2.3 NHX 基因的研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性'>1.3.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白活性'>1.3.3.1 盐胁迫与 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性
• +/H⁺逆向转运蛋白活性'>1.3.3.2 其它胁迫与Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性
• +/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性'>1.3.3.3 转Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.4 小麦Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• 1.4.1 TaSOS1 基因
• 1.4.2 小麦NHX 基因
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料及处理
• 3.1.2 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 RNA 提取
• 3.2.2 反转录反应
• 3.2.3 TaNHX2 基因的克隆
• 3.2.3.1 引物设计
• 3.2.3.2 PCR 反应体系及条件
• 3.2.3.4 大肠杆菌感受态的制备
• 3.2.3.5 连接产物的转化
• 3.2.3.6 大肠杆菌质粒DNA 的提取
• 3.2.4 TaNHX2 基因的功能验证
• 3.2.4.1 酵母表达载体的构建
• 3.2.4.2 重组质粒DNA 提取
• 3.2.4.3 重组质粒DNA 的检测
• 3.2.4.4 试验中所需酵母培养基
• 3.2.4.5 LiAc 法转化酵母
• 3.2.4.6 酵母质粒DNA 提取
• 3.2.4.7 酵母质粒DNA PCR 检测及酶切检测
• 3.2.4.8 酵母功能互补试验
• 3.2.4.9 转基因酵母离子含量测定
• 3.2.5 TaNHX2 基因的定位
• 3.2.5.1 定位重组载体的构建
• 3.2.5.2 拟南芥原生质体制备
• 3.2.5.3 PEG 法转化拟南芥原生质体
• 3.2.5.4 激光共聚焦显微镜检测
• 3.2.6 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）
• 3.2.6.1 荧光定量PCR 引物
• 3.2.6.2 实时荧光定量PCR
• 3.2.7 TaNHX2 突变体基因的功能验证
• 3.2.7.1 TaNHX2 突变体基因的克隆
• 3.2.7.2 TaNHX2 突变体酵母表达载体的构建
• 3.2.7.3 酵母功能互补试验
• 4 结果与分析
• 4.1 TaNHX2 基因的克隆及生物信息学分析
• 4.1.1 TaNHX2 基因的克隆
• 4.1.2 TaNHX2 基因的生物信息学分析
• 4.2 转TaNHX2 基因酵母的功能互补验证
• 4.2.1 pYES2-TaNHX2 重组质粒的构建
• 4.2.2 转基因酵母功能验证
• 4.3 转TaNHX2 基因酵母细胞的离子含量测定
• 4.4 TaNHX2 基因的定位
• 4.5 TaNHX2 基因在各种胁迫下的表达量分析
• 4.5.1 RNA 及cDNA 检测
• 4.5.2 标准曲线的建立
• 4.5.3 熔解曲线
• 4.5.4 TaNHX2 基因在各种胁迫下的特异性表达
• 4.5.4.1 NaCl 胁迫下TaNHX2 基因的表达模式
• 4.5.4.2 4℃低温胁迫下TaNHX2 基因的表达模式
• 4.5.4.3 ABA 胁迫下TaNHX2 基因的表达模式
• 4.5.4.4 PEG6000 胁迫下TaNHX2 基因的表达模式
• 4.6 TaNHX2 的功能域分析
• 4.6.1 TaNHX2 突变体基因的克隆
• 4.6.2 转TaNHX2 突变体基因酵母的功能互补验证
• 4.6.3 酸性条件对突变体功能影响
• 5 结论与讨论
• 5.1 TaNHX2 的生物信息学分析
• 5.2 TaNHX2 的耐盐性分析
• 5.3 不同胁迫下TaNHX2 基因的表达
• 5.4 TaNHX2 突变体基因耐盐性分析
• 参考文献
• ABSTRACT