人脑胶质瘤中ING4和CTGF的表达及其相关性的实验研究

论文摘要

胶质瘤是中枢神经系统最为常见的恶性肿瘤,预后差,尤其是高级别胶质瘤。虽然目前手术结合放化疗的治疗方案也有了一定的进展,但整体对胶质瘤患者预后的改善并不理想。随着分子生物学的发展,对胶质瘤发生的分子机制、相关信号转导、侵袭恶变过程都取得了一定的研究,其中与胶质瘤密切相关的基因、分子的功能也逐渐被重视。目前研究认为,胶质瘤的分子病因和其他肿瘤类似,与原癌基因的激活及抑癌基因的缺失有着密切的联系。在研究胶质瘤的起源、发展的过程中,发现许多重要的分子、基因和蛋白,它们对胶质瘤的作用各不相同,相互之间也有着明显的区别和联系。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是CCN家族成员之一,是由于富含半胱氨酸蛋白61（cystein rich 61,Cyr61）、CTGF和肾母细胞瘤过度表达基因（nephroblastoma overexpressed gene,NOV）是这个家族的最初成员,所以称该家族为CCN家族,目前已在人和多种动物的多种组织中检测到CCN家族成员的表达,并推测该家族基因起源于4千万年前的同一基因。CCN家族的翻译产物均为富含半胱氨酸的分泌型多肽,作为CCN家族的重要成员之一,CTGF与细胞增生、组织分化、胚胎的发育成长、损伤修复、瘢痕愈合、动脉粥样硬化,肝脏、肺、肾脏的纤维化及肿瘤的发生、发展等密切相关。而进一步认识CTGF在人脑胶质瘤发生、发展中的作用对从分子水平诊断及治疗胶质瘤有着重大的理论意义。近年来,脑肿瘤的基因治疗获得突飞猛进的发展,并逐渐走向成熟,而临床研究也证实脑肿瘤的基因治疗是一种新颖而且有希望的疗法。肿瘤基因治疗的方法是把需要的目的基因用特殊的转移技术移入靶细胞,靶细胞便可以获得目的基因具有的功能,从而起到对肿瘤细胞的杀伤和抑制作用,有的还可以避免正常细胞受到放化疗的副损伤。ING4 （Inhibitor of growth famility,member4,ING4）便是近年来发现的一种较新的肿瘤抑制基因,广泛参与肿瘤发生、发展的多个进程,包括肿瘤血管的生长、细胞缺氧状态的适应、抑制肿瘤细胞侵袭转移以及参与细胞生长周期的调节等。ING4属于生长抑制因子（inhibitor of growth,ING）家族成员之一,ING4基因是2003年Shiseki寻找ING1和ING2的相似序列时发现并克隆的,目前体外的众多实验研究表明ING4基因可能具有阻止细胞周期进程、抑制血管生成及促进细胞凋亡的作用。由此看来,ING4作为一种重要的肿瘤生长抑制因子,其本身对肿瘤特有的抑制功能对研究胶质瘤的基因治疗提供了新的途径,认识ING4对胶质瘤细胞的作用及影响,对下一步从基因角度更加有效的干预胶质瘤进展有着重要的意义。本文采用SYBR染料法实时荧光定量PCR技术对30例人脑胶质瘤生长抑制因子4（ING4）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达量进行检测,同时结合免疫组织化学方法观察二者在显微镜下表达特征,初步探讨二者在胶质瘤中发生、发展中的作用及其相关性。目的通过SYBR染料法实时荧光定量PCR方法检测30例人脑胶质瘤及10例正常脑组织中生长抑制因子4（ING4）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA相对表达水平,同时结合免疫组织化学方法观察二者在显微镜下表达特征,探讨ING4、CTGF的表达水平与胶质瘤级别的关系以及目前存在的作用机制,并分析二者在胶质瘤中表达量的相关性。方法根据WHO中枢神经系统肿瘤分类（2000）标准对所取的30例胶质瘤标本进行病理学分型及分级：Ⅰ级5例,Ⅱ级12例,Ⅲ级4例,Ⅳ级9例。其中规定Ⅰ、Ⅱ级为低级别组,共17例,Ⅲ、Ⅳ级为高级别组,共13例。正常对照组,共10例,取自术中需要内减压的重型颅脑损伤病人,取内减压切除的非功能区脑组织作为对照研究标本。所取标本均分为两份,一份标本置于10%福尔马林液浸泡固定备用,石蜡包埋切片。另一份标本采集后立即置入液氮,转-80℃超低温冰箱长期冻存备用。且所有患者术前均未接受化、放疗或者其他生物治疗。低温冰箱冻存标本处理如下：将大约100mg组织标本加入研磨器,加入1ml的TRLzol Rengent （invitrogen,美国）研磨20-30min；直到看不到大块的组织。将液体倒入灭菌后的离心管内,加三氯甲烷250μl,上下颠倒充分混匀,静置5min,4℃离心,13000 r/min,10min。取上清液500μl于另一灭菌过的离心管（EP）内,加入等量的异丙醇,混匀后放入4℃的冰箱15min后取出,4℃离心,13000 r/min,10min；倾倒出上面的液体,留在管底的白色沉淀即为RNA。加入75%的乙醇1ml,4℃离心,7500 r/min,5min。加入适量的去离子水加以溶解。逆转录合成cDNA：逆转录试剂盒购自（invitrogen,美国）。在1.5ml艾本德离心管（Eppendorf管）中加入RNA 2μg、oligo（dt）18引物1μl及DEPC-H20至12μl,混匀,振荡3-5s。放置70℃,5min。混合物在65℃加热5min后,迅速置于冰上冷却,加入5x buffer （pH7.2-7.5） 4μl、0.1M DTT 2μl、RNase inhibitor 1μl。37℃孵育2min,在室温下加入M-MLV逆转录酶（M-MLV Reverse Transcriptase） 1ul,37℃孵育50min,70℃加热15min。实时荧光定量PCR检测：采用实时荧光定量PCR Detection System（SLAN,上海,HONGSHI）检测。以β-肌动蛋白（β-Actin基因）的表达作为内参。PCR反应体积为25μl,内含cDNA,10×Buffer （pH7.2-7.5）,2.5μl; SYBR Green mix （TOYOBO公司,日本）,12.5μl, ddH2O,8μl;引物（5pmol/μ1）,2μ1.反应条件为：95℃60s,然后95℃15s,退火15Ss,72℃45s,40个循环。β-Actin的RT-PCR反应体系及条件同CTGF和ING4。计算方法为简化的2-AACt法。在计算ING4基因的表达量时,以同一份标本的ING4循环阈（Cycle threshold） Ct阈值即反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数减β-Actin Ct值,设其为△Ct。各标本的0.5△Ct即为与正常脑组织表达ING4的均值之比,ING4基因的表达水平（相对于正常脑组织,用百分数表示）。同法计算CTGF基因的表达水平。用SPSS13.0软件统计分析数据,计量资料经过正态性检验和方差齐性检验,以x±s表示。单因素方差分析有差异时进一步行两两之间的比较采用Bonferroni法。二者表达的相关性采用Spearman秩相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。石蜡包埋标本按以下处理：组织切片常规脱蜡、脱水；3%H202去离子水孵育10分钟,蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0）,微波炉加热至沸腾后断电,间隔10分钟,反复两次进行热修复抗原；滴加5%BSA封闭液,室温20分钟；滴加生物素化兔抗人CTGF多克隆抗体、ING4单克隆抗体,50uml/张,放置于4℃冰箱中孵育过夜后PBS洗2min×3次；滴加生物素化羊抗兔IgG,室温下20分钟,PBS（PH7.2—7.6）洗；滴加试剂SABC,室温下20分钟,PBS洗5分钟×4次；DAB显色：取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片,室温显色18分钟；苏木素轻度复染；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。显微镜下观察CTGF、ING4表达特征。结果1、在正常组ING4 mRNA表达量为（103.1±20.2）%,低级别组（Ⅰ-Ⅱ级）为（49.9±10.4）%,高级别组（Ⅲ-Ⅳ级）为（16.7±6.89）%；在正常组CTGFmRNA表达量为（103.0±31.8）%,低级别组（Ⅰ-Ⅱ级）为（281.1±68.6）%,高级别组（Ⅲ-Ⅳ级）为（672.4±99.7）%。2、ING4在正常组、低级别组、高级别组表达量的比较3组中ING4表达量的比较,差异均有统计学意义（P=0.000<0.01）；3组中ING4表达量均值不全相等（P=0.000<0.01）。进一步对3组的ING4表达量进行两两比较,统计结果显示：正常组中ING4的表达量高于低级别组（P=0.000<0.01）,低级别组中ING4的表达量高于高级别组（P=0.000<0.01）,正常组中ING4的表达量显著高于高级别组（P=0.000<0.01）,其中正常组中ING4的表达水平最高,低级别组次之,高级别组中ING4的表达量最低。即随着肿瘤级别增加ING4表达量有逐渐降低的趋势。3、CTGF在正常组、低级别组、高级别组表达量的比较3组中CTGF表达量的比较,差异均有统计学意义（P=0.000<0.01）；3组中CTGF表达量均值不全相等（P=0.000<0.01）。进一步对3组的CTGF表达量进行两两比较,统计结果显示：高级别组中CTGF的表达量高于低级别组（P=0.000<0.01）,低级别组中CTGF的表达量高于正常组（P=0.000<0.01）,高级别组中CTGF的表达量明显高于正常组（P=0.000<0.01）,其中高级别组中CTGF的表达水平最高,低级别组次之,正常组中CTGF的表达量最低。即随着肿瘤级别增加CTGF表达量有逐渐升高的趋势。4、根据ING4和CTGF在30例胶质瘤标本的表达情况,进行Spearman秩相关分析,显示两者在胶质瘤中的表达呈负相关（γ=-0.723,P=0.000<0.01）。5、免疫组织化学结果显示ING4蛋白在细胞质和细胞核内均有表达,且在正常脑组织中表达丰富,在胶质瘤组织中表达减少；而CTGF蛋白阳性产物主要位于瘤细胞胞质,呈棕褐色颗粒,CTGF蛋白在正常脑组织中表达降低,在高级别胶质瘤中表达丰富。结论①CTGF mRNA在人脑胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织,且随肿瘤级别的增高,表达水平也相应增高,而ING4 mRNA在人脑胶质瘤中的表达水平则显著低于正常脑组织,且随肿瘤级别的增高而降低。提示CTGF和ING4与胶质瘤的发生、发展有关。②CTGF mRNA和ING4 mRNA在人脑胶质瘤中的表达水平呈负相关。结果说明两者能协同作用,共同作用于人脑胶质瘤的发生、发展过程。且二者联合检测可以作为判断胶质瘤恶性程度的参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 研究背景
• 参考文献
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间成果
• 统计学证明
• 致谢