食管鳞癌抑癌基因启动子甲基化及微卫星不稳定的研究

论文摘要

食管鳞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发生是一个多阶段,涉及遗传学及表观遗传学的复杂过程,近年来表观遗传学改变在恶性肿瘤的发生、发展中的作用越来越受到重视,其中抑癌基因启动子甲基化作为影响基因表达的新机制被广泛研究,已陆续有文献报道其在预后方面的价值,而食管鳞癌中有关抑癌基因甲基化与临床病理特征及预后之间关系的研究相对较少。微卫星不稳定则是近年来恶性肿瘤研究的又一热点,微卫星不稳定是基因组不稳定的表现,导致细胞增殖及分化异常,促进肿瘤的发生,许多肿瘤中都发现了微卫星不稳定,而食管鳞癌中有关微卫星不稳定的研究结果差异较大。有关微卫星不稳定与hMLH1基因甲基化之间的关系尚无定论,国内也未见相关报道。因此本研究选取p16INK4a、E-cadherin及hMLH1三个抑癌基因,探讨抑癌基因甲基化在食管鳞癌发生发展中的作用,并对微卫星不稳定在食管鳞癌中的发生情况及与hMLH1基因异常之间的关系做初步的研究。现对上述研究内容分别报告如下:第一部分食管鳞癌hMLH1、E-cadherin、p16INK4a基因启动子甲基化的研究目的:1.检测食管鳞癌癌组织及配对正常组织中hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因启动子甲基化的发生情况。2.评价上述三基因甲基化在食管鳞癌发生发展中所起到的作用。方法:收集整理105例食管鳞癌患者的临床病理资料,采用酚—氯仿法提取这105例食管鳞癌癌组织及配对癌旁正常组织的基因组DNA,运用甲基化特异PCR（Methylation Specific PCR,MSP）的方法对所提DNA分别进行hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因甲基化检测,抽选MSP产物进行普通测序或克隆测序,验证PCR扩增结果。采用Envision二步法对癌组织中hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因蛋白表达进行免疫组化检测。分析上述三个抑癌基因甲基化在食管鳞癌及配对正常组织中的发生情况及与临床病理特征的关系。结果:1.癌组织E-cadherin、hMLH1及p16INK4a。基因启动子甲基化的阳性率分别为57.1%（60/105）、20.9%（22/105）和50.5%（53/105）,正常食管粘膜相应三个基因甲基化阳性率分别为10.5%（11/105）、1.9%（2/105）和7.6%（8/105）,E-cadherin（P=0.002）、hMLH1（P=0.042）及p16INK4a（P=0.004）基因在癌组织中的甲基化率均显著高于正常食管粘膜。2.食管鳞癌E-cadherin、hMLH1及p16`（INK4a）蛋白表达阳性率分别为51.4%（54/105）、78.1%（82/105）、28.6%（30/105）,E-cadherin（P=0.021）及p16INK4a（P=0.026）基因启动子甲基化与相应蛋白失表达显著相关,而hMLH1基因甲基化与蛋白表达无相关性。3.E-cadherin基因启动子甲基化的食管鳞癌中淋巴结转移更多见（P=0.016）,p16INK4a基因启动子甲基化的食管鳞癌中低分化癌更多见（P=0.024）,hMLH1基因启动子甲基化与各项临床病理特征无显著关联。结论:1.食管鳞癌中p16INK4a及E-cadherin基因启动子甲基化较常见,癌组织的甲基化率均远高于癌旁正常食管组织,并且导致蛋白失表达,这两个甲基化位点与食管鳞癌密切相关。2.p16`（INK4a）基因启动子甲基化与肿瘤低分化有关,但与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移等无关,提示这一变化可能出现在食管鳞癌发生的早期阶段。E-cadherin基因启动子甲基化与淋巴结转移有关,提示其在食管鳞癌的恶性进展中可能起到一定的作用。3.食管鳞癌中有一定频率的hMLH1基因启动子甲基化,但与蛋白表达无关,与各项临床病理特征也无关,可能并不直接参与食管鳞癌的发生发展。第二部分食管鳞癌术后复发危险因素的研究目的:1.分析食管鳞癌术后两年内复发转移的发生情况及与临床病理因素的关系。2.评价hMLH1、E-cadherin及p16INK4a基因甲基化对于复发的预测价值。方法:回顾分析了2006年1月至2007年2月在复旦大学附属肿瘤医院接受了食管癌二野清扫根治手术的患者105例,总结术后两年内复发情况,结合第一部分甲基化的检测结果,应用Pearson卡方检验或精确概率法比较复发率的差异,应用Logistic回归分析判定肿瘤复发的危险因素。结果:1.2年内41例（39%）患者复发。局部-区域性复发占21例（51.2%）,其中纵隔淋巴结复发11例（52.4%）,颈部淋巴结复发5例（23.8%）。血行转移占17例（41.5%）,以肺（6例）、骨骼（5例）和肝（3例）为主,共占血行转移的82.3%,局部-区域性复发与血行转移同时发生3例（7.3%）。2.单因素分析显示淋巴结转移数目（P＜0.001）、浸润深度（P=0.002）及淋巴管、血管侵犯（P=0.001）与复发密切相关,其中淋巴结转移数目≥3个的患者术后两年复发率为69%。3.多因素Logistic回归分析显示T3期（P=0.023）,淋巴结转移数目（P=0.001）是术后复发的独立危险因子,淋巴管、血管侵犯不是独立危险因素。4.无淋巴结转移食管鳞癌患者中,E-cadherin基因甲基化是唯一与复发相关的因素,有甲基化患者的复发率显著高于无甲基化患者（33.3%VS4.2%,P=0.031）。结论:1.食管癌二野清扫术后两年内39%的患者出现复发,纵隔淋巴结、颈部淋巴结、肺、骨及肝是主要的复发部位,术后应重点对这些部位定期复查。2.T3及淋巴结转移数目是食管鳞癌术后复发的危险因素,其中淋巴结转移数目≥3枚的患者术后两年复发比例很高,应考虑采取更积极的治疗方法。3.E-cadherin基因启动子甲基化与无淋巴结转移食管鳞癌的术后复发显著相关,可以考虑将其作为新的分子标志物用于复发的预测。第三部分食管鳞癌微卫星不稳定及与hMLH1基因改变之间关系的研究目的:1.检测食管鳞癌中微卫星不稳定及hMLH1基因内的D3S1611位点杂合性缺失的发生情况。2.探讨微卫星不稳定在食管鳞癌中的作用及与hMLH1基因改变之间的关系。方法:以第一部分提取的105对癌及癌旁正常组织的基因组DNA为模板,选取BAT-26、D16s265、D9S1748及位于hMLH1基因内的D3S1611共四个微卫星位点进行检测,使用荧光标记引物扩增微卫星片段,产物进行毛细管电泳并由DNA序列检测仪自动收集荧光扫描结果,Genemapper软件进行数据收集及分析,记录并分析上述四个位点的微卫星不稳定发生情况及D3S1611位点杂合性缺失情况。结果:1.食管鳞癌MSI发生率是19%（20/105）,其中D3s1611、D9s1748及D16s265位点分别有8例、5例和7例。BAT-26位点未发现微卫星不稳定,也未发现两个位点同时有MSI（MSI-H）的病例,20例均为MSI-L。2.MSI-L与各项临床病理因素均无显著关联。3.hMLH1基因内D3s1611位点的杂合性缺失率为58.6%,但与hMLH1蛋白失表达及hMLH1基因甲基化均无显著关系。4.MSI-L与hMLH1基因甲基化、杂合性缺失及蛋白失表达均无显著关系。结论:1.食管鳞癌中仅存在一定比例的低度微卫星不稳定（MSI-L）,未发现高度微卫星不稳定（MSI-H）。2.MSI-L与各项临床病理因素均无关,在食管鳞癌的发生发展中可能不起关键作用。3.hMLH1基因异常可能不是MSI-L发生的原因。3.hMLH1基因内D3s1611位点有较高的杂合性缺失率,hMLH1基因可能是食管鳞癌基因改变的靶点,但基因缺失与甲基化及蛋白表达均无关,是否存在突变等其他异常有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• TNK4a基因启动子甲基化的研究'>第一部分 食管鳞癌hMLH1、E-cadherin、p16^TNK4a基因启动子甲基化的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 食管鳞癌术后复发危险因素的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 食管鳞癌微卫星不稳定及与hMLH1基因改变之间关系的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 附录:攻读博士学位期间发表及待发表的论文题录
• 致谢
• 附录