论文摘要
目的：制备表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）纳米微粒并对其微粒形貌、粒径、载药率、包封率和释放情况进行评价；进行EGF纳米微粒的体外细胞研究，应用小鼠成纤维细胞L929细胞系，采用MTT法进行EGF纳米微粒的体外细胞实验，检测和评价EGF纳米微粒生物学活性，研究微粒载体的毒性。采用EGF纳米微粒治疗DM大鼠溃疡，比较EGF纳米微粒和EGF两种不同剂型对糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠溃疡作用的差异，探讨EGF纳米微粒促愈合作用的机制。方法：1．利用改进的复乳法，以聚乳酸-羟基乙酸（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）作为载体，制备EGF纳米微粒。2．透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）对EGF纳米微粒形貌表征。3．激光粒度仪／Zeta电位仪分析微粒粒径分布。4．应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定EGF纳米微粒载药率、包封率和释药行为。5．L929细胞在培养瓶中培养，控制细胞浓度在1.0×105／ml，接种于细胞培养板上。6．以含有1μg／L，5μg／L，10μg／L，50μg／L，100μg／L浓度的EGF纳米微粒悬液加入细胞培养板中，同时设立对照，培养24小时，用噻唑蓝（Thiazolyl blue，MTT）法测定490hm处的OD值，研究不同浓度EGF纳米微粒对细胞增殖能力的影响。7．以10μg／L浓度的EGF纳米微粒，EGF原液，空微粒加入细胞培养板中，同时设立空白对照。培养24小时，用MTT法测定490nm处的OD值，研究相同浓度不同剂型EGF对细胞增殖的影响。8．以含有0.01μg／L，0.1μg／L，1μg／L，10μg／L，100μg／LEGF浓度相对应的纳米空微粒为梯度，同时设立空白对照，培养24小时，用MTT法测定490nm处的OD值，研究空微粒对细胞是否存在毒性，是否影响细胞增殖。9．尾静脉注射STZ法制备DM大鼠模型。10．用打孔器制备DM大鼠溃疡模型。11．DM溃疡大鼠分为4组：分别为EGF纳米微粒组（A组），EGF原液组（B组），空白微粒组（C组），PBS溶媒对照组（D组），每天给药一次。12．分别于3、7、14、21天照相，计算创面愈合率。13．分别于3、7、14、21天取材，送病理做HE切片和免疫组化（表皮生长因子受体，epidermal growth factor receptor EGFR，增殖核细胞抗原，proliferating cell nuclear antigen，PCNA）。14．于14天取材，做电镜观察。结果：1．EGF纳米微粒粒径大小为150nm，粒径分布比较均一，微粒之间无粘连，分散性好。载药率为0.02％，包封率为85％。释药符合释放动力学模型，微粒在快速渗透阶段快速释放EGF使其达到药物有效浓度，随后在中速渗透阶段和聚合物降解过程中在有效药物浓度范围内缓慢释放EGF，释放长达24小时。2．不同浓度EGF纳米微粒均促进细胞增殖，其中10μg／L为最适浓度（与对照组比，P＜0.01）。3.10μg／L浓度不同剂型EGF对细胞增殖的影响，四组间存在统计学意义（P＜0.01），EGF纳米微粒组与EGF原液组相比有统计学意义（P＜0.01），两组与空白对照和空微粒组相比均有统计学意义（P＜0.01），空白对照组和空微粒组相比没有统计学意义（P＞0.05）。4．不同浓度空微粒对细胞没有毒性，不影响细胞增殖（组间没有差异，P＞0.05）。5．成功制备DM大鼠模型，一次成模率80.7％，二次追加全部成模。6．愈合率显示：在14天开始，A组与B组有差别（P＜0.05）。7．EGFR显示：在7天以后，A组与B组有显著差异（P＜0.01）。PCNA显示：在14天，A组与B组有显著差异（P＜0.01）。8．电镜结果显示：A组成纤维细胞中内质网数量最多，内质网扩张，内含大量胶原蛋白，其他各组成纤维细胞中内质网数量少，胶原颗粒少。结论：成功制备EGF纳米微粒。细胞实验证明EGF纳米微粒制备过程中EGF保持原有活性，EGF纳米微粒与EGF原液比较，EGF纳米微粒促进L929细胞增殖能力更强，微粒载体对细胞没有毒性作用。EGF纳米微粒与EGF原液比较，在治疗DM大鼠溃疡中，促进溃疡愈合更快，更适用于临床的应用。