猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因假病毒的构建

论文摘要

乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）引起的一种蚊媒性人畜共患病,主要流行于热带和亚热带地区,我国是JE的高发区,曾一度占世界的80%。猪感染JEV主要临床症状为种猪的繁殖障碍和仔猪神经症状。同时,猪是JEV的扩增宿主和越冬宿主,在“猪—蚊—人”链状传播中扮演着极其重要的作用,监控和预防猪的JE有助于人JE预防和控制。本研究通过对山西运城某猪场疑似JEV感染的仔猪进行病毒的分离与鉴定,并分析其分子演化规律和JE在我国不同地区的分布和流行情况,为进一步预防和控制猪和人的JE提供技术资料。同时,构建了JEV E基因介导的假病毒,研究病毒与宿主细胞受体互作功能结构域,为今后JEV入侵机制研究和抗病毒药物研发奠定基础。1、猪源乙型脑炎病毒的分离与鉴定2009年7月从山西运城某养猪场采集疑似感染JEV的病猪脑组织,通过RT-PCR扩增和免疫组化等方法共检测到7份JE阳性病料。通过对RT-PCR扩增的240bpC/prM片段序列进行进化树分析表明这7份病料均为基因Ⅰ型的JEV阳性,Genbank登录号为：HQ893545-HQ893551。分别将这7份阳性病料接种BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离,结果在这两种细胞上各分离到一株JEV,分别命名为：SX09S-01和SX09S-02。对分离到的病毒在乳鼠脑组织上进行病毒扩增并测定毒价。病毒感染Vero细胞超薄切片电镜观察发现到40-60nm的病毒粒子,呈现典型的JE病毒粒子特征。在此基础上,对SX09S-01株全基因组进行测定和序列分析。其全基因组全长为10965bp,含5’-UTR-96bp,3’-UTR-570bp, ORF-10299bp。其5’-UTR增加了一个腺嘌呤A,3’-UTR在终止密码子TAG后出现了13个核苷酸的缺失。与21株JEV全基因序列进行比较,其核苷酸和氨基酸都与XJ69株的同源性最高。为了确定所分离的毒株的毒力,首先分析JEV E蛋白上与病毒毒力密切相关的的8个关键氨基酸,发现分离到的两株JEV SX09S-01和SX09S-02的E蛋白具有强毒株的典型特征。其次,在小鼠上测定了它们的神经毒力和神经侵袭力。将SX09S-01和SX09S-02分别通过脑部和腹腔接种途径接种4周龄的Balb/C小鼠,神经毒力和神经侵袭力分别为0.62、5.87和0.77、5.77。实验结果证明SX09S-01和SX09S-02都是强毒株,但其神经毒力和神经侵袭力均低于P3强毒株。另外,为了分析JEV基因Ⅲ型血清对分离的基因Ⅰ型病毒的中和能力,我们将制备的Ⅲ型血清对基因Ⅲ和基因Ⅰ型病毒进行了中和试验,结果表明基因Ⅲ型血清对基因Ⅰ型病毒有中和能力,较基因Ⅲ病毒中和能力弱,但差异并不显著。通过统计中国各省JEV基因型的分布情况,发现中国主要流行基因Ⅰ型和基因Ⅲ型,而基因Ⅰ型JEV在70年代后才开始出现,2005年以后基因Ⅰ型JEV呈上升趋势,其出现频率已高于基因Ⅲ型JEV。从现有统计数据来看,目前,我国除了青海省没有JEV报道外,其他各省份均出现过JE病例。并且多省份出现基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的混合感染,如山西、四川、辽宁、云南、广西、湖北、河南、陕西、贵州、福建和上海等地。而在北京、新疆、黑龙江、广东和台湾只流行基因Ⅲ型,甘肃、山东、浙江和江西则只流行基因Ⅰ型。JEV在我国不同省份所出现的基因型不尽相同。2、JEV E基因假病毒的构建JEV受体及其入侵的机制目前尚不明确,而E蛋白是与细胞受体互作的关键蛋白。为了研究JEV E蛋白与病毒受体互作功能域、宿主嗜性以及抗病毒药物,本研究利用了HIV-1型慢病毒载体系统构建JEV E基因假病毒。首先将E基因分段扩增,分别含有全长E基因（E1500）,去掉一个跨膜区E基因（E1437）,去掉两个跨膜区E基因（E1299）,只含有区域Ⅰ和Ⅱ的E基因（E12）以及只含有区域Ⅲ的E基因（E3）。然后将这5个E基因片段都连接到包装质粒载体上,最后通过与转移质粒和辅助质粒共转染293FT细胞获得重组的慢病毒。共转染后48h 293FT细胞均能发亮绿色荧光,Western blotting检测证实各基因在293FT细胞中都得到表达。将获得的重组慢病毒转导哺乳动物细胞293FT和BHK-21,利用流式细胞仪检测荧光率,计算重组慢病毒的转导滴度。结果只在293FT细胞上检测到了荧光阳性信号,但所有的重组慢病毒的转导荧光率都很低,其中以E12和E3基因获得的重组慢病毒转导滴度稍高,分别为1.65±0.37×103和1.32±0.95×103。而在BHK-21细胞上所有的样品均未检测到荧光阳性信号。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 文献综述
• 1.1 乙型脑炎的历史及流行病学
• 1.1.1 乙型脑炎的历史
• 1.1.2 JE的流行病学与致病性
• 1.2 JE的病原学特性
• 1.2.1 JEV的分类及理化特性
• 1.2.2 JE的生物学特性
• 1.2.3 致病机制
• 1.3 JE的分子生物学特性
• 1.3.1 JEV的基因结构
• 1.3.2 JEV的蛋白质
• 1.4 JEV感染的临床症状与病理变化
• 1.4.1 临床症状
• 1.4.2 病理变化
• 1.5 JE的诊断方法
• 1.6 JE的防治
• 1.7 慢病毒载体简介
• 1.7.1 慢病毒载体基本结构
• 1.7.2 慢病毒载体的应用
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌株
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 培养基及其配制
• 3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR或酶切产物的回收纯化
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 重组质粒的小量制备（OMEGA小提试剂盒）
• 3.2.7 重组质粒的大量制备（OMEGA去内毒素大提试剂盒）
• 3.2.8 细胞的传代
• 3.2.9 猪源JEV的分离与鉴定
• 3.2.10 JEV E基因假病毒的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 猪源JEV的分离与鉴定
• 4.1.1 病料的检测
• 4.1.2 病毒基因型的分析
• 4.1.3 病毒的分离与鉴定
• 4.1.4 JEV SX09S-01和SX09S-02株电镜观察
• 4.1.5 JEV SX09S-01全基因组的测序与序列分析
• 4.1.6 JEV SX09S-01和SX09S-02株的扩增
• 4.1.7 JEV SX09S-01和SX09S-02毒力的测定
• 4.1.8 血清中和实验
• 4.1.9 中国JEV基因型分布分析
• 4.2 JEV E基因假病毒的构建
• 4.2.1 E基因不同片段重组质粒的构建
• 4.2.2 HIV-1型慢病毒载体系统的验证
• 4.2.3 E基因重组慢病毒的获得
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 猪源JEV的分离与鉴定
• 5.1.2 JEV E基因假病毒的构建
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录