家蝇幼虫蛋白提取物的抗病毒、抗氧化及护肝作用研究

论文摘要

家蝇是一种世界性分布的昆虫,繁殖系数高,生活周期短,养殖技术简单,被国际上列为新型蛋白源昆虫之首。家蝇从幼虫到成虫均生活在杂菌孳生的环境里,蛆体表面及体内含有大量的病菌,能在人类和动物间传播多种疾病,它们极强的抗病能力成为了科学家们研究的热点。本文以家蝇幼虫为研究对象,从家蝇幼虫体内提取了生物活性蛋白物质,并研究了其抗病毒、抗氧化和护肝作用,主要研究结果如下:1.家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒作用在体外,采用鸡胚法和乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒检测了家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒活性。实验结果表明:不同浓度的家蝇幼虫组织匀浆液对流感病毒在鸡胚内的增殖都有显著的抑制作用。试剂盒的检测结果也说明:家蝇幼虫组织匀浆液在体外对乙肝病毒表面抗原有很好的破坏作用,其破坏率可达87.5%。2.家蝇幼虫活性蛋白的提取、分离纯化及活性研究以脱脂蝇蛆粉为材料,根据蛋白质溶解性的不同,从家蝇幼虫体内提取了5类蛋白质,并分别研究了其抗病毒和抗氧化的活性。对其中含量高并且抗氧化和抗病毒活性好的组分进行了进一步的分离,并且确定了最佳的制备工艺。采用阳离子交换色谱将蛋白质提取物进一步分离并检测了各组分的抗病毒活性。研究结果表明:脱脂蝇蛆粉中清蛋白的含量最高,并且抗氧化和抗病毒活性最好,以此为目的蛋白,进一步分离得到蛋白质提取物。蛋白质提取物的最佳提取条件为pH 7.0,盐浓度0.18mol/L。从蛋白质提取物中分离出4个蛋白质组分A1-4,抗病毒活性显示,这4个组分对流感病毒有一定的抑制作用,但活性与蛋白质提取物相比没有提高。3.蛋白质提取物抗新城疫病毒的活性采用鸡胚的方法研究了蛋白质提取物对新城疫病毒在鸡胚内增殖的抑制作用。毒性实验表明:给鸡胚注射不同浓度的蛋白质提取物后,鸡胚存活率均为100%。说明蛋白质提取物对鸡胚的生长发育没有影响,基本上不产生毒性作用。抗病毒实验结果表明:蛋白质提取物的各个剂量组均能不同程度的抑制新城疫病毒在鸡胚内的增殖。4.蛋白质提取物抗脊髓灰质炎病毒的活性采用细胞培养的方法,体外检测了蛋白质提取物对病毒感染细胞的抑制作用。通过终点稀释法研究了蛋白质提取物与病毒在体外中和后,对病毒的抑制作用;检测了蛋白质提取物对100个TCID50病毒的最低抑制浓度,并计算治疗指数。结果表明:蛋白复合物对Hela细胞的半数有毒浓度CC50为331.13μg/mL。蛋白质提取物与病毒直接作用后可使病毒的感染滴度下降两个数量级。对100个TCID50脊灰病毒的治疗指数大于33,说明蛋白质提取物具有很好的抗脊灰病毒的作用。5.蛋白质提取物抗禽流感病毒的活性采用血凝的方法检测了蛋白质提取物在体外对禽流感H9N2病毒的杀灭作用。实验结果表明:蛋白质提取物对鸡血红细胞的毒性作用比较小,在5 mg/mL以下没有观察到毒性作用。蛋白质提取物与病毒混合一段时间之后进行血凝实验检测,病毒的血凝效价比病毒对照组显著降低。6.蛋白复合物抗疱疹病毒的活性采用细胞培养的方法,体外检测了蛋白质提取物在体外与病毒中和作用、病毒和蛋白质提取物同时加入以及先加蛋白质提取物后加病毒三种作用方式下蛋白复合物抗疱疹病毒的作用。结果表明:蛋白复合物对Vero细胞的半数中毒浓度CC50为236.63μg/mL。在前两种作用方式下,蛋白复合物显示出很好的抗疱疹病毒的作用;而蛋白质提取物对细胞的保护作用检测结果发现,蛋白质提取物先与细胞作用一段时间后,对病毒的感染力基本上没有影响。该结果说明蛋白质提取物可能不是通过对细胞的保护作用起作用的。7.蛋白复合物抗人流感病毒的活性采用细胞培养的方法,让病毒感染细胞,并采用血凝的方法检测了病毒感染细胞后培养的上清液中病毒的滴度。实验结果表明:蛋白质提取物对MDCK细胞的半数中毒浓度CC50为284.45μg/mL。不同浓度的蛋白质提取物在体外与病毒中和后,能显著地降低病毒的感染力,而阳性药物病毒唑的作用却不太明显。当药物与病毒同时加入时,蛋白质提取物与病毒唑对病毒在细胞内的增殖都起到了很好的抑制作用。蛋白质提取物和病毒唑对细胞的保护作用都不强,均不能有效地抑制病毒增殖。病毒唑对病毒感染的治疗作用比较强,而蛋白质提取物对病毒直接杀灭的能力比较强。这预示蛋白质提取物可能具有与病毒唑不同的作用机理。8.家蝇幼虫蛋白质提取物的抗氧化作用分别采用脱氧核糖-铁体系法以及邻苯三酚自氧化法测定了蛋白质提取物的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的作用。抗氧化实验结果表明:蛋白质提取物具有很好的抗羟基自由基和清除超氧阴离子自由基的作用。蛋白质提取物清除羟基自由基的IC50为1.23 mg/mL。当蛋白质提取物浓度为34.63μg/mL时则能清除50%的超氧阴离子自由基,当浓度达到1 mg/mL时则能完全抑制超氧阴离子自由基的产生。9.家蝇幼虫蛋白质提取物的护肝作用以四氯化碳所致肝损伤为模型,从生化指标和病理组织两个方面研究了蛋白质提取物对四氯化碳导致的小鼠肝损伤的保护作用。实验结果发现,四氯化碳造模很成功。灌胃蛋白质提取物以后能显著地降低由四氯化碳所导致的AST和ALT的升高,提高肝脏合成蛋白质的能力。肝组织病理切片显示:四氯化碳损伤组与正常对照组相比,肝脏均表现出典型的中毒性肝损伤病理改变;而蛋白质提取物的三个剂量组肝脏形态与结构基本完好,没有出现细胞坏死。从以上生化指标和病理组织两个方面的结果可以看出:蛋白质提取物对四氯化碳诱导的肝损伤具有很好的保护作用。本研究的结果表明:从家蝇幼虫体内提取的蛋白质提取物具有很好的抗病毒、抗氧化和护肝作用,对人体没有毒副作用,具有很好的临床应用价值。

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中文摘要

Abstract

缩略词表

第一章文献综述

1 病毒及其研究概况

1.1 病毒对人类的危害

1.2 抗病毒研究的现状

1.2.1 病毒疫苗

1.2.2 抗病毒药物

1.2.3 抗病毒研究存在的问题

2 天然抗病毒药物研究现状

2.1 抗病毒蛋白

2.1.1 Mx蛋白

2.1.2 商陆蛋白

2.1.3 蓝藻抗病毒蛋白

2.1.4 其他抗病毒蛋白/肽

2.2 抗病毒多糖类

2.3 抗病毒生物碱类

2.4 抗病毒萜类

2.5 其它的抗病毒活性物质

3 昆虫抗病毒蛋白/肽类的研究

3.1 家蚕抗病毒蛋白

3.2 烟芽夜蛾抗病毒肽

3.3 丽蝇抗病毒肽

3.4 昆虫细胞中抗病毒蛋白

4 天然抗氧化和护肝产物研究的必要性

4.1 抗氧化

4.2 护肝

5 研究的目的与意义

6 研究的内容及技术路线

6.1 本课题的研究内容

6.2 本研究的技术路线

第二章家蝇幼虫组织匀浆液的抗病毒活性研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 虫源

2.1.2 病毒

2.1.3 病毒唑

2.1.4 十日龄鸡胚

2.1.5 纯化的乙型肝炎表面抗原（HbsAg）

2.1.6 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒

2.2 实验方法

2.2.1 病毒的接种（尿囊腔法）

2.2.2 鸡胚接种后的检查

2.2.3 尿囊液的收获

2.2.4 微量法血凝实验

2.2.5 病毒滴度的测定

2.2.6 组织匀浆液的制备

2.2.7 家蝇幼虫组织匀浆液对鸡胚的毒性作用

2.2.8 家蝇幼虫组织匀浆液抗流感病毒作用

2.2.9 家蝇幼虫组织匀浆液抗乙型肝炎病毒表面抗原作用

3 结果与分析

3.1 家蝇幼虫组织匀浆液对鸡胚的毒性作用

3.2 家蝇幼虫组织匀浆液抗流感病毒作用

3.3 家蝇幼虫组织匀浆液对乙型肝炎病毒表面抗原的破坏作用

4 讨论

第三章家蝇幼虫活性蛋白的分离纯化及理化性质分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 虫源

2.1.2 病毒

2.1.3 细胞

2.1.4 主要试剂

2.1.5 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 脱脂蝇蛆粉的制备

2.2.2 蛋白质含量的测定

2.2.3 脱脂蝇蛆粉中活性蛋白的提取及含量测定

2.2.4 组分蛋白的活性研究

2.2.5 盐溶蛋白的提取条件

2.2.6 化学成分分析

2.2.7 CM52阳离子交换色谱分离

2.2.8 抗病毒活性

3 结果与分析

3.1 家蝇幼虫蛋白质组分的含量

3.2 家蝇幼虫蛋白组分的活性

3.2.1 抗氧化活性

3.2.2 清蛋白抑制羟基自由基活性

3.2.3 球蛋白抑制羟基自由基活性

3.2.4 各组分蛋白对鸡胚的毒性

3.2.5 抗流感病毒活性

3.3 盐溶蛋白提取的条件

3.3.1 考马斯亮蓝G-250标准曲线

3.3.2 pH值、盐浓度对蛋白质提取率的影响

4）₂SO₄分级沉淀'>3.4 （NH₄）₂SO₄分级沉淀

3.4.1 蛋白质沉淀等电点测定

3.4.2 盐析法分离家蝇幼虫盐溶蛋白

3.5 蛋白质提取物的最佳制备工艺

3.6 蛋白质提取物的主要化学成分

3.7 蛋白质提取物的氨基酸组成

3.8 蛋白质提取物的紫外扫描

3.9 CM52阳离子交换色谱分离

3.10 抗病毒检测

4 讨论

第四章家蝇幼虫蛋白质提取物的抗病毒活性研究

1 蛋白质提取物抗新城疫病毒的活性研究

1.1 前言

1.2 材料和方法

1.2.1 实验材料

1.2.2 实验方法

1.3 统计学分析

1.4 结果与分析

50)'>1.4.1 病毒滴度(EID₅₀)

1.4.2 蛋白质提取物对鸡胚的毒性

1.4.3 蛋白质提取物对新城疫病毒增殖的抑制作用

1.5 讨论

2 蛋白质提取物抗脊髓灰质炎病毒的活性研究

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 材料

2.2.2 仪器设备

2.2.3 试剂

2.2.4 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 PV-1引起的细胞形态的变化

2.3.2 病毒感染滴度的测定

2.3.3 蛋白质提取物对Hela细胞的毒性

2.3.4 蛋白质提取物对脊髓灰质炎1型病毒的灭活

50脊灰病毒的最低抑制浓度'>2.3.5 蛋白质提取物对100个TCID₅₀脊灰病毒的最低抑制浓度

2.4 讨论

3 蛋白质提取物抗禽流感病毒的活性研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 实验方法

3.3 统计学分析

3.4 结果与分析

3.4.1 蛋白质提取物的细胞毒性

3.4.2 蛋白质提取物抗病毒作用

3.5 讨论

4 蛋白质提取物抗疱疹病毒的活性研究

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 材料

4.2.2 仪器设备和主要试剂

4.2.3 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 蛋白质提取物对Vero细胞的毒性

4.3.2 病毒与药物在体外中和

4.3.3 药物与病毒同时加入

4.3.4 先加药物后加病毒

4.4 讨论

5 蛋白质提取物抗人流感病毒的活性研究

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.2.1 材料

5.2.2 仪器设备和主要试剂

5.2.3 实验方法

5.3 统计学分析

5.4 结果与分析

5.4.1 蛋白质提取物对MDCK细胞的毒性

1N₁引起的细胞形态的变化'>5.4.2 流感病毒H₁N₁引起的细胞形态的变化

5.4.3 药物与病毒在体外中和

5.4.4 药物与病毒同时入

5.4.5 先加药物后加病毒

5.4.6 先加病毒后加药物

5.5 讨论

第五章家蝇幼虫蛋白质提取物的抗氧化作用研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 蛋白质提取物

2.2 清除羟基自由基的作用

2.3 清除超氧阴离子自由基的作用

3 结果与分析

3.1 清除羟基自由基活性

3.2 清除超氧阴离子自由基活性

4 讨论

第六章家蝇幼虫蛋白质提取物的护肝作用研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 蛋白质提取物

2.1.2 实验动物

2.2 试剂

2.3 主要仪器

2.4 实验方法

2.4.1 蛋白质提取物的急性毒性试验

2.4.2 动物分组

2.4.3 动物的处理

2.4.4 实验动物体重的测定

2.4.5 血清AST和ALT活性的测定

2.4.6 10%肝匀浆组织液的制备

2.4.7 生化指标检测

2.4.8 常规病理学检查

3 统计学分析

4 结果与分析

4.1 急性毒性试验

4.2 蛋白质提取物对AST和ALT的活性的影响

4.3 蛋白质提取物对MDA、GSH以及总蛋白的影响

4.4 蛋白质提取物对小鼠肝重和体重的影响

4.5 蛋白质提取物对小鼠肝脏组织的影响

4.5.1 形态学观察

4.5.2 病理组织切片观察

5 讨论

5.1 四氯化碳诱导肝损伤模型

5.2 蛋白质提取物对ALT和AST的影响

5.3 蛋白质提取物对MDA的影响

5.4 蛋白质提取物对GSH的影响

5.5 蛋白质提取物对蛋白质合成的影响

第七章全文总结与展望

1 全文总结

2 本研究的创新点

3 研究展望

参考文献

致谢

附录一攻读博士学位期间发表论文

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