非特异性结合对CYP3A4酶促反应动力学的影响

论文摘要

在药物研发中,利用体外数据来预测人体内药物代谢性质的早期ADME 性质研究方法极大地提高了药物开发的能力,但是,体外研究中复杂的影响因素直接影响了体外数据的真实性,进而对预测的准确性产生影响。因此,在药物研发中,体外影响因素的研究对于开发出具有良好药代动力学性质的药物具有着重要意义。作为最重要的药物代谢酶,CYP3A4 参与了近50%临床药物的代谢,是这些药物从体内清除的主要限速酶。CYP3A4 的影响因素决定了体外研究中众多化合物的代谢性质能否准确预测。本文旨在探讨非特异性结合对于CYP3A4 酶促反应动力学的影响,完善CYP3A4 的体外代谢模型,从而确保得到准确的药物代谢动力学参数及进行体内药物清除的准确预测。本研究以CYP3A4 的探针底物及其特异反应——睾酮6β羟基化和硝苯地平氧化反应来指示CYP3A4 的活性,利用平衡透析和高效液相色谱法,对睾酮、硝苯地平在鼠肝微粒体和人肝微粒体体系中的非特异性结合进行了定性、定量分析。睾酮和硝苯地平与鼠肝和人肝微粒体体系均存在较弱的非特异性结合,在鼠肝和人肝微粒体体系中二者的游离比例分别为:睾酮0.84±0.07 和0.75±0.05,硝苯地平0.87±0.04 和0.83±0.03。通过两种微粒体体系的相互验证,证明睾酮、硝苯地平与微粒体体系的非特异性结合均为等比例不可饱和的非特异性结合,即实验体系中药物的游离浓度和结合浓度均随着加入药物总浓度的增加而增加,但是游离比例基本保持不变。进一步就非特异性结合对CYP3A4 催化的睾酮6β羟基化反应和硝苯地平氧化反应动力学的研究显示,排除非特异性结合影响后,两个肝微粒体体系中,睾酮和硝苯地平原有的S 形动力学曲线均左移、曲线形状趋近于经典米氏方程的矩形双曲线形状,而且Eadie-Hofstee 作图均有直线化趋势。同时利用Hill 方程进行动力学参数的计算,Vmax和Hill 系数n 基本无变化,但S50却被高估,进而导致对于药物清除的预测CLmax的低估。本研究表明,非特异性结合对于CYP3A4 催化机理研究及代谢动力学参数的正确评估具有重要作用。这提示,非特异性结合是酶促反应动力学研究中不容忽视的一个重要影响因素,直接影响了体外数据的真实性和利用体外数据来预测人体内药物代谢性质的准确性。

论文目录

• 中文摘要
• 第一章 文献综述——药物代谢体外研究中的影响因素
• 1 从药物体外代谢数据预测其体内肝清除率
• 2 药物代谢酶
• 2.1 细胞色素P450 概述
• 2.2 CYP3A
• 3 体外代谢研究中的影响因素
• 3.1 药物的理化性质
• 3.1.1 药物的解离度对体外研究的影响
• 3.1.2 药物的溶解度和分配系数对体外研究的影响
• 3.2 非特异性结合
• 3.2.1 结合的类型
• 3.2.2 非特异性结合中游离药物的测定方法
• 3.2.3 非特异性结合的研究进展
• 4 展望
• 第二章 睾酮和硝苯地平与肝微粒体非特异性结合的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 器材
• 1.2 方法
• 1.2.1 肝微粒体的提取和蛋白含量的测定
• 1.2.2 睾酮和硝苯地平的标准曲线
• 1.2.3 平衡透析
• 1.2.4 数据处理
• 2 结果
• 2.1 肝微粒体的蛋白含量
• 2.2 睾酮和硝苯地平的标准曲线及方法验证
• 2.2.1 睾酮的标准曲线及方法验证
• 2.2.2 硝苯地平的标准曲线及方法验证
• 2.3 睾酮与肝微粒体的非特异性结合
• 2.4 硝苯地平与肝微粒体的非特异性结合
• 2.5 睾酮和硝苯地平非特异性结合的比较
• 3 讨论
• 第三章 非特异性结合对睾酮6?羟基化反应动力学的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 睾酮与肝微粒体非特异性结合的测定
• 1.2.2 睾酮6β羟基化反应活性的测定
• 1.2.3 睾酮6β羟基化反应动力学研究
• 2 结果
• 2.1 睾酮6β羟基化反应
• 2.2 非特异性结合对睾酮6β羟基化反应动力学的影响
• 2.2.1 鼠肝微粒体
• 2.2.2 人肝微粒体
• 2.3 非特异性结合对睾酮6β羟基化反应动力学参数的影响
• 3 讨论
• 第四章 非特异性结合对硝苯地平氧化反应动力学的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 硝苯地平与肝微粒体非特异性结合的测定
• 1.2.2 硝苯地平氧化反应活性的测定
• 1.2.3 硝苯地平氧化反应动力学研究
• 2 结果
• 2.1 硝苯地平氧化反应
• 2.2 非特异性结合对硝苯地平氧化反应动力学的影响
• 2.2.1 鼠肝微粒体
• 2.2.2 人肝微粒体
• 2.3 非特异性结合对硝苯地平氧化反应动力学参数的影响
• 3 讨论
• 第五章 结论——非特异性结合对于CYP3A4酶促反应动力学的影响
• 1 非特异性结合的性质
• 2 实验体系对非特异性结合的影响
• 3 非特异性结合对CYP3A4酶促反应动力学的影响
• 3.1 非特异性结合对动力学模型的影响
• 3.2 非特异性结合对动力学参数的影响
• 4 总结
• 第六章 总结及展望
• 1 结论
• 2 创新点
• 3 后续工作
• 英文摘要
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文独创性声明
• 学位论文版权的使用授权书