鸡舍环境中镰孢菌的种类及真菌毒素检测

论文摘要

本研究利用tri5特征性引物对分离自包括空气、饲料、土壤、积尘和饮用水在内的鸡舍环境基质中的镰孢菌分离株基因组DNA扩增来快速筛选产毒镰孢菌,并通过正交试验设计方法对tri5阳性菌株进行产毒培养,采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱（HPLC）方法对产毒培养产物和鸡舍空气及基质样品进行T-2毒素和HT-2毒素进行定性和定量分析,明确T-2毒素和产毒镰孢菌的数量关系,在建立空气和周围基质之间镰孢菌—产毒镰孢菌—T-2和HT-2毒素量化关系的基础上,初步探明鸡舍气载镰孢菌及T-2毒素的发生规律,为人类和动物气传真菌病的预防和控制提供理论依据。分别在2009年11月和2010年4月采集鸡舍空气样品19份,基质（包括土壤、积尘、饲料、饮用水）样品共164份。对10份空气样品和40份基质样品中的镰孢菌进行分离鉴定,得到来自空气中的59株和来自其他基质中的80株共139株镰孢菌分离株,其中拟轮枝镰孢和半裸镰孢为优势菌种,所占比例分别为23.74%和17.26%。不同类型基质中,土壤中的镰孢菌浓度最高;不同类型鸡舍中,种鸡舍中获得的镰孢菌分离株最多。tri5-PCR对139株镰孢菌分离株的基因组DNA进行特异性扩增,得到42株tri5+镰孢菌,其中tri5+菌株数量最多的镰孢菌种类为禾谷镰孢菌,土壤中分离筛选的tri5+镰孢菌的比例最高。对空气中得到的10株tri5+镰孢菌按照40号F. semitectum的最佳产毒培养条件进行产毒培养,HPLC检测培养产物,7株镰孢菌产生T-2毒素,浓度范围为1.3ng/mL5ng/mL,3株产生了HT-2毒素,浓度最高为17.1ng/mL。按照国家检验检疫局质量检测标准,采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱方法检测鸡舍环境基质中的T-2毒素（包括HT-2毒素）、黄曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和赭曲霉毒素A（OTA）。检测结果表明,所有环境基质中均检测到T-2毒素,以土壤中的毒素浓度最高,为21μg/kg,除饲料以外的基质中未检测到OTA和ZEA的存在,饲料中的OTA和ZEA水平在冬季和春季有明显差异,冬季与春季饲料样品中的ZEA浓度具有显著差异（P<0.05）,所有样品中均未检测到AF的检测结果在检测方法定量限以下。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 镰孢菌及产毒镰孢菌
• 1.1.1 镰孢菌的研究意义
• 1.1.2 镰孢菌的分类
• 1.1.3 空气中的镰孢菌
• 1.2 单端孢霉烯族毒素产毒基因
• 1.2.1 tri 基因簇
• 1.2.2 利用tri 基因簇研究镰孢菌
• 1.3 真菌毒素
• 1.3.1 常见真菌毒素
• 1.3.2 真菌毒素的检测技术
• 1.3.3 真菌毒素的检测现状
• 2 鸡舍镰孢菌多样性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品的采集
• 2.1.2 镰孢菌的分离和鉴定
• 2.1.3 数据统计方法
• 2.1.4 不同基质中镰孢菌分布的相关性分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 鸡舍环境中镰孢菌种类及形态特征
• 2.2.2 鸡舍环境中镰孢菌种类分布特征
• 2.2.3 空气与其他基质中镰孢菌浓度相关性分析
• 2.3 讨论
• 3 tri5 基因阳性镰孢菌筛选及其产毒培养
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 供试镰孢菌
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 镰孢菌基因组DNA 快速提取与测定
• 3.2.2 tri5-PCR 筛选产毒镰孢菌菌株
• +菌株产毒培养'>3.2.3 tri5⁺菌株产毒培养
• 3.2.4 高效液相色谱法（HPLC）检测产毒培养产物
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 镰孢菌基因组 DNA 提取
• 3.3.2 tri5-PCR 筛选产毒镰孢菌
• +镰孢菌'>3.3.3 不同基质中tri5⁺镰孢菌
• 3.3.4 最佳产毒培养条件
• +镰孢菌产毒培养检测'>3.3.5 tri5⁺镰孢菌产毒培养检测
• 3.4 讨论
• 4 鸡舍环境基质中真菌毒素的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与仪器
• 4.1.2 实验步骤
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 鸡舍环境基质中真菌毒素检测结果
• 4.2.2 不同季节饲料中赭曲霉毒素 A 与玉米赤霉烯酮比较
• 4.2.3 不同基质中 T-2 毒素浓度
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢