论文摘要
水孔蛋白属于主要膜内蛋白家族,是一种水分跨膜运输的功能性的通道蛋白。植物细胞的生长、发育与细胞内的水分状况密切相关,在生长发育过程中不同水孔蛋白在时空上的特异表达表明它们参与了植物生理活动的方方面面。植物组织在体外培养过程中会出现失去对外源激素的依赖性形成激素驯化细胞的现象,但目前为止激素驯化的生理机制尚未被揭示。我们在研究激素驯化人参细胞的生长机理时首次发现并克隆了在驯化细胞中特异表达的人参液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1,并对它的生理功能进行了研究。本论文的工作分两部分,第一部分是激素驯化人参细胞系的建立,第二部分是人参液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1的克隆和功能研究。激素驯化是指体外培养的植物细胞失去对外源生长因子需要的稳定的可遗传的特征,这种现象在胡萝卜、烟草、马铃薯、甜菜、大豆等多种植物中有过报道。我们从依赖外源生长素和细胞分裂素培养的人参细胞系出发,通过驯化、筛选获得了不依赖任何外源激素培养的细胞系,并且细胞的生长状态和生长速度与激素依赖细胞系相似。通过扫描电镜进行的细胞形态观察结果也表明两类细胞的形态和大小均无明显差异。人参总皂甙含量的测定结果显示激素驯化人参细胞系的皂甙含量高于激素依赖细胞系,同时,反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的结果进一步证明了皂甙合成关键酶鲨烯合成酶（SQS）和鲨烯环氧酶（SQE）基因在激素驯化人参细胞中的表达高于激素依赖的人参细胞,暗示了激素驯化人参细胞系可能具有更强的皂甙合成能力。由于外源施加的激素类物质会在一定程度上给培养物带来毒副作用,因此培养激素驯化细胞对植物细胞工程的研究和发展具有重要的意义。通过抑制差减杂交和cDNA文库的筛选,我们发现并克隆了激素驯化人参细胞系中特异表达的液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1。以激素驯化人参悬浮细胞为材料,对施加外源KT(0.25 mg l-1)和2,4-D(1.5 mg l-1)处理时PgTIP1的表达变化作检测,实时（Realtime）荧光RT-PCR的结果表明,KT能够显著上调PgTIP1的表达,而2,4-D处理则抑制了PgTIP1的表达,二者共同作用时PgTIP1表达也明显受到了抑制,以上结果无论是在对植物细胞激素驯化机理的探讨中还是在对水孔蛋白的研究中都是没有报导过的。由于PgTIP1是首次克隆到的人参水孔蛋白基因,我们还从生物信息学和体外功能验证上对其进行了进一步确认。PgTIP1的序列分析和结构预测结果均表明它具有水孔蛋白的特征性序列和结构,爪蟾卵母细胞表达实验也证明了PgTIP1是一个功能性的水孔蛋白。将PgTIP1与GFP融合表达对其进行的定位分析表明它主要定位于液泡膜上。由于PgTIP1特异表达于不依赖外源激素培养的细胞中,我们推测它极有可能参与了植物细胞的生长发育。通过在拟南芥中过量表达人参液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1,我们对它的生理功能作了初步研究。结果表明,过表达PgTIP1拟南芥的早期生长发育速度快于野生型拟南芥,主要表现在根的长度增加、叶细胞变大及开花时间早于野生型对照。另外,过表达PgTIP1拟南芥的种子大小和重量都高于野生型拟南芥种子,同时,种子中的脂肪酸含量达到了野生型的1.85倍。以上结果表明PgTIP1不仅能够促进细胞的生长,而且还可能在植物种子中的物质储藏和脂类代谢中起作用。