玉米基因组DNA甲基化水平及其与杂种优势关系的研究

论文摘要

DNA甲基化是表观遗传学的主要表现形式,普遍存在于动植物基因组中,参与调控基因的表达,维持基因组的稳定性。DNA的胞嘧啶通过发生甲基化和去甲基化两个过程,调控动植物的生长和发育。玉米作为主要的杂交育种材料,经历了从传统育种到分子育种的变革。越来越多的研究表明植物胚乳的发育受到母本印记的调控,来自母本的一些基因大量表达,然而,一些来自父本基因被甲基化修饰,其表达受到抑制。因此,对玉米种子发育过程中基因表达差异的研究,寻找与优良形状相关的基因,将会有助于改良玉米的品质和提高产量。MSAP技术即甲基化敏感扩增多态性,1998年熊立仲首次使用MSAP技术研究水稻杂交种F1及其亲本间的不同甲基化模式,该技术是基于AFLP方法,选用甲基化敏感的两个同裂酶,研究基因组甲基化多态性。由于该方法具有需用少量的DNA,即可检测出甲基化多态性,并且便于操作,现被广为采用。本实验选用目前国内大面积种植的郑单958为材料,采用MSAP技术,寻找影响其产生优良性状的基因。郑单958是以郑58为母本,昌7-2为父本,人工授粉后得到的杂交种,由于其产量高,抗倒伏且抗病虫害的优良特点,在黄河流域广为种植。玉米在授粉15-20天后,胚乳细胞结束分裂活动,进入营养物质积累时期。目前,国内外对玉米授粉后早期的种子甲基化水平的报道很多,但对种子发育后期营养物质积累与甲基化修饰关系的研究还未见报道。本实验取双亲及杂交种F1代在授粉后第28天的种子,用MSAP技术检测基因组胞嘧啶甲基化水平差异,由于基因发生去甲基化修饰后,其表达水平会得到相应提高,故选择发生去甲基化的片段,克隆后用于测序分析。本研究主要得到以下结果:1.本实验对预扩增和选择性扩增的产物,用1.2%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳提前检测,发现预扩增产物成弥散状,这是由于扩增产物片段大小接近,而选择性产物多集中在500bp以下,并且可以粗略看出亲本与杂交种的之间的条带确实存在差异,这大大提高了实验效率。2.将MSAP得到的带型进行统计和数据分析,结果表明:将MSAP甲基化带型划分为5种类型,A为全甲基化型,B为去甲基化型,C为超甲基化型,D为次甲基化型,E是甲基化升高型,其中以去甲基化型和超甲基化型最为显著,分别占MSAP总条带数的33.7%和35.8%。3.对玉米亲本自交系及杂交种种子CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平的分析表明,杂交种的非甲基化率为55%高于中亲值53.3%,杂交种的甲基化水平为20.4%,低于中亲值21.8%,可能是大量片段发生了去甲基化所致,因为MSAP带型中去甲基化型占33.7%。杂交种F1代DNA甲基化模式经历了较大的调整,以协调来源双亲的异质基因的协同表达,使得某些基因高效转录,而有些基因转录受到抑制,杂交优势的产生可能与杂交种F1代基因组DNA甲基化模式的改变与重新调整有关。4.对F1代种子甲基化遗传模式的分析表明,母本甲基化模式占总条带数的46%,而父本甲基化遗传模式占总条带数的4.8%,说明子代基因组的甲基化遗传主要是来自母本基因组,而其中又以半甲基化模式为主,它占总甲基化条带数的28.9%。5.选取发生去甲基化的11条片段用于克隆测序,片段大小为100bp-300bp之间,与玉米基因组的同源性分析表明,去甲基化位点多发生在未知基因的启动子区域和EST序列,其中,E4H6-1编码一个6磷酸葡萄糖酸内酯酶,参与戊糖磷酸途径;E4H6-3标签对应的基因编码一个与水稻中F-box-like family protein同源的蛋白,它参与泛素降解途径的SCF复合物的组成:E2H5-1、E2H5-3、E1H5-1、E3H4-1和E3H4-2分别编码与水稻中同源的功能未知蛋白质;E2H5-2、E1H1-3和E1H3-1序列是玉米基因组中的分子标签（EST）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 甲基化的发生机制
• 1.1.1 植物基因组甲基化的研究历史及其分布特点
• 1.1.2 甲基化转移酶与其它参与甲基化过程的蛋白质
• 1.1.3 RNA介导的DNA甲基化
• 1.1.4 De novo甲基化与去甲基化
• 1.2 甲基化的作用
• 1.2.1 甲基化对植物生长发育的影响
• 1.2.2 DNA甲基化模式的传递及遗传性
• 1.2.3 甲基化调控植物基因表达
• 1.2.4 甲基化在植物防御中的作用
• 1.3 基因组甲基化水平的检测方法
• 1.3.1 依赖重亚硫酸盐的检测方法
• 1.3.2 MSAP甲基化敏感扩增多态性
• 1.3.3 高效液相色谱（HPLC）法
• 1.3.4 MicroarrayDNA甲基化分析
• 1.4 甲基化与作物杂种优势的关系
• 1.4.1 杂种优势遗传机理的最新研究进展
• 1.4.2 基因的差异表达与杂种优势
• 1.4.3 调控基因的表达与杂种优势
• 1.4.4 分子标记遗传差异与杂种优势
• 1.4.5 DNA甲基化与杂种优势
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 MSAP及克隆去甲基化片段的实验
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂
• 2.2.1 提取玉米种子基因组DNA所用试剂
• 2.2.2 克隆去甲基化片段所需试剂
• 2.3 主要仪器
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 玉米种子基因组DNA的提取
• 2.4.2 MSAP方法检测步骤
• 2.4.3 克隆去甲基化的片断
• 2.5 实验结果与分析
• 2.5.1 预扩增和选择性扩增产物的琼脂糖电泳检测
• 2.5.2 玉米亲本及其杂交种的不同甲基化类型
• 2.5.3 玉米亲本及其杂交种在胞嘧啶的甲基化水平
• 2.5.4 玉米亲本自交系和杂交子一代间的甲基化遗传模式
• 2.5.5 去甲基化差异片段的克隆和检测
• 第3章 讨论:
• 3.1 预PCR和选择性PCR后琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2 玉米郑58、昌7-2及F1的28DAP种子的甲基化相对水平
• 3.3 玉米郑58、昌7-2及F1的28DAP种子甲基化的遗传分析
• 3.4 去甲基化片段的序列分析
• 第4章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的科研成果