肺癌热休克蛋白70-多肽复合物的抗瘤免疫效应研究及其与热证的相关性

论文题目: 肺癌热休克蛋白70-多肽复合物的抗瘤免疫效应研究及其与热证的相关性

论文类型: 博士论文

论文专业: 中医基础理论

作者: 胡晨霞

导师: 王洪琦

关键词: 热休克蛋白,热休克蛋白一多肽复合物,肿瘤疫苗,证候,肺癌

文献来源: 广州中医药大学

发表年度: 2005

论文摘要: 证候是中医学的重要理论,指导着中医对疾病发生、发展及其表现的认识,是认识疾病和辨证论治的主要依据。证候研究一直是中医基础研究的重大课题。当今,分子生物学作为现代生命科学的前沿学科为中医证候研究提供了有利条件,从基因和蛋白质水平探讨中医证候机理,已引起众多研究者的关注。 热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)作为分子伴侣,参与蛋白质的合成、折叠、运输、降解等过程,在维持细胞的正常结构和功能等方面发挥着重要的作用;作为细胞热保护因子,用于保护细胞自身免受损伤,提高细胞的应激能力特别是耐热能力,并参与多种疾病的病理过程,在机体的肿瘤免疫、抗感染等免疫中充当着重要的角色。其中分子量为70kD的热休克蛋白(heat shock protein70,HSP70)被研究得最为深入。已清楚HSP70在正常生理条件下有一定水平的基础表达,当细胞处于高温、缺氧等应激状态时,转录活化诱导表达增加。此外,近年来的研究又表明,HSP70不仅仅只是在应激状态下的瞬间高表达,在许多疾病如肿瘤、炎症、创伤、衰老、心血管疾病、免疫性疾病等病理过程中也超量表达,尤其是在肿瘤发生发展过程中的重要作用已经被认识到。有研究报道在肿瘤进展过程中,HSP70在多种恶性肿瘤组织呈高表达,可以作为肿瘤进展的标志物,并且可以参与肿瘤的主动免疫过程。 九十年代初,国外有研究发现从高表达HSP70的动物肿瘤组织细胞分离纯化的HSPs制剂具有针对该肿瘤的特异性抗肿瘤免疫效应,而源于正常组织细胞的HSPs则对任何肿瘤都不具有保护性免疫反应,这引起了国外学者的高度关注。考虑到HSPs分子具有高度保守性,肿瘤组织与正常组织来源的HSP70分子结构并没有差异,诱发其特异性抗肿瘤效应的应该不是HSP70分子本身。因此,他们开始寻找该HSPs制剂发挥抗肿瘤效应的真正物质基础。结果发现,从肿瘤组织提取的HSP70制剂中发挥肿瘤特异性的抗原信息与其所携带的小分子抗原肽有关,抗原肽的分离会导致免疫原性的丧失,HSP70本身并不具有免疫原性。已证实小鼠肿瘤组织细胞来源的HSP分子包括HSP70、HSP90、gp96等都是肽结合蛋白,能够伴侣、提呈和加工处理抗原肽及激活抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),在体内与胞内多肽结合形成热休克蛋白-多肽复合物(heat shock protein-peptide complexes,HSP—PC),激发针对其来源的特定肿瘤的保护性免疫反应。目前,针对热休克蛋白70-多肽复合物(heat shock protein70-peptide complexes,HSP70—PC)抗肿瘤效应的研究主要还集中在动物实验方面,有关人类肺癌HSP70—PC抗肿瘤效应及其肿瘤免疫作用机制方面仍有大量未明之处。国外虽已开始将人体肿瘤来源HSP—PC作为肿瘤疫苗投入到临床试验研究中,但病种也只局限于肝癌、肾癌、恶性黑色素瘤等,且临床反应有效率低,不同患者之间疗效差异很大,限制了其在不同个体的广泛应用。基于热应激是

论文目录:

引言

文献回顾

第一节 中医证候研究现状

1.中医证候概念的探讨

2.中医证候现代研究进展与展望

第二节 HSP70在肿瘤免疫领域的研究进展

1.热休克蛋白70在肿瘤中的表达调控及意义

2.热休克蛋白70-多肽复合物在肿瘤免疫领域的应用基础研究

3.肿瘤疫苗热休克蛋白—多肽复合物的临床应用研究

实验研究

第一节 本课题主要研究内容及技术路线

1.研究目标

2.研究内容

3.研究方法

4.技术路线

第二节 HSP70-PC的提取、分离和纯化

1.实验材料

1.1 病例选择和样本收集

1.2 主要试剂

1.3 主要实验器材

1.4 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 实验技术路线

2.2 实验步骤

2.2.1 组织总蛋白的制备

2.2.2 ADP-agarose亲和层析

2.2.3 SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.4 DEAE离子交换层析

3 实验结果

3.1 ADP亲和层析纯化结果

3.2 DEAE离子交换层析纯化结果

第三节 HSP70-PC的定性鉴定和定量检测

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 主要实验器材

1.3 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 实验技术路线

2.2 Western-blot定性鉴定

2.2.1 SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.2 转膜

2.2.3 抗体杂交

2.2.4 DAB显色反应

2.3 Bradford定量检测

3 实验结果

3.1 Western-blot定性鉴定结果

3.2 Bradford定量结果

第四节 人肺癌A-549肿瘤细胞的培养

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 主要试剂

1.3 主要实验器材

1.4 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 冻存细胞复苏

2.2 培养细胞换液

2.3 肿瘤细胞传代培养

2.4 细胞计数

2.5 培养细胞冻存

3 实验结果

第五节 不同证候患者肺癌及远端正常肺组织HSP70-PC对人肺癌细胞的影响

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 外周静脉抗凝血

1.3 主要试剂

1.4 主要实验器材

1.5 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离

2.2 HSP70-PC促淋巴细胞增殖效应试验

2.3 HSP70-PC的肿瘤细胞毒功能试验

2.4 统计学分析

3 实验结果

3.1 人外周血单个核细胞(PBMC)分离结果

3.2 HSP70-PC促淋巴细胞增殖效应的检测

3.3 HSP70-PC肿瘤细胞毒功能的检测

讨论

第一节 HSP70-PC分离纯化方法学探讨

第二节 不同证候患者肺癌HSP70-PC抗肿瘤免疫效应的探讨

结语

参考文献

附录

1.中英文缩略词表

2.附图 1：DEAE离子交换柱纯化后蛋白洗脱液SDS—PAGE结果

3.附图 2：ADP亲和层析柱纯化后蛋白洗脱液SDS—PAGE结果

致谢

发布时间: 2005-07-22

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