利用酵母双杂交技术筛选与hPYGO2相互作用蛋白

论文摘要

Pygopus蛋白最早在果蝇中作为Wg（哺乳动物同源蛋白Wnt）信号通路中的特殊组分被发现的,由此引发了对其功能机理的研究。令人吃惊的是,在果蝇Wg信号转导途径中具有专一功能的Pygopus在小鼠中却有着双重功能,在Wnt相关和Wnt独立的通路中均发挥作用。本文介绍了经典的Wnt信号通路和现阶段对Pygopus蛋白功能的研究情况,并进一步分析了Pygopus蛋白两个保守的结构域在转录过程中的作用。以hPYGO2△NHD为诱饵蛋白筛选人乳腺文库后,我们得到70个阳性克隆。阳性克隆测序并将测序结果用BLAST分析,13,5,22,35阳性克隆的氨基酸序列分别与CDC73（cell division cycle 73）、BCL6（B-cell CLL/lymphoma 6）、CDC34（cell division cycle 34homolog）、EEF1G（eukaryotic translation elongmion factor 1 gamma）四种蛋白具有高度的同源性。在进一步的实验中,我们成功地构建了哺乳动物表达载体p3×Flag-CMV-hpygopusΔNHD,pcDNA3.1-Myc-cdc73和pCMV5-Myc-bc16三个融合蛋白在293T细胞中均有效表达。其中,通过Co-IP和荧光素报告酶检测实验证明pcDNA3.1-Myc-cdc73与p3×Flag-CMV-hpygopusΔNHD之间存在相互作用,其他蛋白还需要继续验证。通过以上实验,我们认为筛选出的4个蛋白在酵母中和hPYGO2△NHD之间存在相互作用。其中,CDC73在人类中为Parafibromin,它是PAF蛋白复合物中的一个成员,参与核内Wg/Wnt信号转导过程:BCL6是一个转录抑制子。推测BCL6蛋白能抑制p53肿瘤抑制因子基因的表达;CDC34是泛素连接酶家族的一员,这个蛋白是一个大的蛋白复合体的一部分,在泛素化介导的细胞周期G1调控子的降解和DNA复制起始的过程中需要它的参与。EEF1G是真核生物转录延伸因子,因为PYGO2有转录激活活性,猜测其可能与转录延伸有关。这些发现对进一步了解hPYGO2△NHD的功能,最终阐明Wnt信号通路的机制都有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 Wnt信号通路
• 1.1.1 经典wnt信号通路概述
• 1.2 Wnt信号中的PYGO蛋白
• 1.2.1 果蝇中和哺乳动物的Pygopus
• 1.2.2 Pygopus和癌症
• 1.2.3 Pygopus蛋白的转录共激活功能
• 1.2.4 Pygopus在转录调控中发挥功能的机制
• 1.2.5 Pygopus蛋白研究现状
• 1.3 酵母双杂交系统的基本原理及应用
• 1.3.1 酵母双杂交系统的理论基础
• 1.3.2 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3的作用原理
• 1.3.3 酵母双杂交的应用
• 1.3.4 酵母双杂交的局限性
• 1.4 本课题的主要目的和技术路线
• △NHD的构建与鉴定'>第二章 诱饵质粒pGBKT7-hpygopus2^△NHD的构建与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器与设备
• 2.2 实验方法
• △NHD蛋白'>2.2.1 PCR扩增hPygo2^△NHD蛋白
• △NHD重组质粒的构建'>2.2.2 PGBKT7-hpygopus2^△NHD重组质粒的构建
• 2.2.3 大肠杆菌的转化
• 2.2.4 酵母转化
• 2.2.5 诱饵质粒在AH109中表达的鉴定
• 2.3 结果
• △NHD的PCR结果'>2.3.1 hpygopus2^△NHD的PCR结果
• △NHD的鉴定'>2.3.2 重组质粒pGBKT7-hpygopus2^△NHD的鉴定
• △NHD转入AH109'>2.3.3 pGBKT7-hpygopus2^△NHD转入AH109
• 2.3.4 诱饵质粒自激活测试结果
• 2.3.5 诱饵质粒表达的检测
• 2.4 讨论
• 第三章 人乳腺文库的筛选
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要材料与试剂
• 3.1.2 主要仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 人乳腺cDNA文库的滴度测定、扩增、质粒抽提和质量鉴定
• 3.2.2 酵母宿主细胞AH109的表型验证
• 3.2.3 cDNA文库的转化和营养缺陷筛选
• 3.2.4 酵母质粒DNA的提取
• 3.2.5 酵母质粒DNA转化大肠杆菌
• 3.2.6 大肠杆菌质粒DNA的小量快速抽提
• 3.2.7 重转化排除假阳性
• 3.2.8 DNA序列分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 酵母细胞AH109的表型验证
• 3.3.2 人乳腺cDNA文库的滴度测定及扩增
• 3.3.3 文库的初步筛选
• 3.3.4 再次共转化及重新确认结果
• 3.3.5 测序结果及分析
• 3.4 讨论
• 第四章 哺乳动物体内相互作用的检测
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和细胞
• 4.1.2 质粒
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 细胞培养所需试剂
• 4.1.5 细胞转染所需试剂
• 4.1.6 细胞裂解液
• 4.1.7 抗体
• 4.1.8 蛋白酶抑制剂
• 4.1.9 荧光素酶LUC活性测定所需试剂
• 4.2 实验方法
• △NHD'>4.2.1 构建p3×Flag-CMV-hpygopus^△NHD
• 4.2.2 构建pcDNA3.1-Myc-cdc73
• 4.2.3 构建pCMV5-Myc-bc16
• 4.2.4 质粒的扩增
• 4.2.5 细胞培养与传代
• 4.2.6 瞬时转染
• 4.2.7 细胞裂解与蛋白收取
• 4.2.8 免疫印迹分析
• 4.2.9 荧光素酶LUC活性测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组质粒进行限制性酶切鉴定
• 4.3.2 重组质粒进行测序鉴定
• 4.3.3 重组质粒的表达检测
• 4.3.4 哺乳动物体内相互作用
• 4.3.5 荧光素酶活性测定
• 4.4 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢