乙酰化修饰在二型干扰素受体介导的信号通路中作用的研究和溶瘤腺病毒对PLC细胞作用机制的研究

论文摘要

蛋白质的转录翻译后修饰在生命活动中扮演着重要的角色，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等。乙酰化可以调节组蛋白和非组蛋白的活性。最近又有文章报道乙酰化可以调节代谢循环中相关酶的活性。现在乙酰化修饰已经成为了研究的热点。虽然已经发现了很多蛋白质的乙酰化修饰，但有关二型干扰素受体（IFNgR）的乙酰化修饰的研究却很少。本课题主要从两方面研究乙酰化在IFNgR介导的信号通路中的作用。一方面，我们研究IFNgR是否会发生乙酰化以及乙酰化对其功能的影响。另一方面，我们研究STAT1新的乙酰化位点以及这些新位点对其功能的影响。IFNgR乙酰化修饰方面，我们构建了能够表达IFNgR1Full Lengt（hIFNgR1FL）、IFNgR1Cytoplasmic Domain（IFNgR1CD）、IFNgR2FL和IFNgR2CD的质粒，同时也构建了一系列IFNgR1CD的点突变体和截断体。然后经IP和Western blot等方法检测发现：在CBP的作用下IFNgR1FL、IFNgR1CD和IFNgR2FL会发生明显的乙酰化修饰，而IFNgR2CD基本检测不到乙酰化修饰。我们已经送出乙酰化IFNgR1FL和IFNgR2FL的蛋白样品，用于质谱分析。对于IFNgR1CD突变体的实验发现，K271,272、K303、K459和K473是IFNgR1CD发生乙酰化的关键位点。STAT1乙酰化修饰方面，我们用IP和Western blot实验发现内源的STAT1在IFN-γ的诱导下会发生乙酰化；质谱的结果显示我们发现了STAT1新的乙酰化位点(K193和K697)，STAT1的K193R和K697R突变体的实验结果进一步证实了这两个位点是STAT1发生乙酰化的关键位点；Western blot和荧光素酶报告基因检测显示K193和K697的乙酰化修饰不影响STAT1同源二聚体的形成并且对STAT1的转录活性的影响不如Y701那样显著。本课题还将进一步深入研究，希望为乙酰化修饰的研究出一份力。溶瘤腺病毒Ad.sp-E1A（△24）-IL-24对人肝癌细胞株PLC的作用机制尚不清楚。采用流式细胞仪检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A（△24）以及Ad.sp-E1A（△24）-IL-24处理48h后细胞周期的变化；利用Western blot检测PLC经PBS、Ad.sp-E1A（△24）以及Ad.sp-E1A（△24）-IL-24处理24h、48h后细胞中凋亡信号相关蛋白表达量的变化。实验结果表明：Ad.sp-E1A（△24）和Ad.sp-E1A（△24）-IL-24能将PLC细胞周期阻滞在S期，S期比值分别为（43.74±6.61）%，（49.48±7.60）%，两者与未感染病毒的对照组（18.91±1.83）%进行统计学差异分析，P值均<0.05；同时，Western blot检测发现随着处理时间的增加，病毒处理组中CHOP的表达量，Caspase12的剪切水平及STAT3、p38MAPK的磷酸化水平都有明显提高，尤其以Ad.sp-E1A（△24）-IL-24处理组相对较为明显，SOCS3的表达量病毒处理组与对照组均没有显著差异。上述结果表明：溶瘤腺病毒Ad.sp-E1A（△24）-IL-24能有效阻滞PLC细胞周期在S期，并可能通过内质网压力、STAT3与MAPK信号通路等多种途径诱发PLC细胞凋亡。

论文目录

• 第一部分 乙酰化修饰在二型干扰素受体介导的信号通路中作用的研究 I
• 摘要
• Abstract
• 第二部分 Survivin 调控的溶瘤腺病毒表达 IL-24 蛋白对人肝癌细胞 PLC 作用机制的探究 III
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 乙酰化修饰在二型干扰素受体介导的信号通路中作用的研究
• 缩略语
• 第一章 蛋白质乙酰化修饰的研究进展
• 1 蛋白质乙酰化修饰研究概况
• 2 乙酰基转移酶和去乙酰化酶
• 2.1 乙酰基转移酶
• 2.2 去乙酰化酶
• 3 干扰素受体（IFNR）的乙酰化
• 3.1 干扰素受体的分类
• 3.2 一型干扰素受体乙酰化研究进展
• 3.3 二型干扰素受体乙酰化研究进展
• 4 JAK-STAT 途径乙酰化修饰的研究进展
• 4.1 STATs 家族及其分类
• 4.2 STAT1 的乙酰化
• 5 乙酰化修饰的研究意义及其展望
• 第二章 实验的目的意义及方案设计
• 1 实验的目的与意义
• 2 实验方案
• 第三章 IFNgR 克隆的构建
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 引物的设计与合成
• 2 方法
• 2.1 6cMyc-IFNgR1FL 和 6cMyc-IFNgR2FL 质粒的构建
• 2.2 6cMyc-IFNgR2CD 质粒的构建
• 3 结果
• 3.1 PCR 结果
• 3.2 双酶切和测序结果
• 第四章 突变体的构建和校正
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 引物的设计与合成
• 2 方法
• 2.1 对 IFNgR1CD 及其突变体和截断体 290 突变的校正
• 2.2 构建 6cMyc-IFNgR1CD K271,272R 突变体及校正 IFNgR1CD K285R 上 290 位的突变
• 2.3 构建带 Flag 标签的 STAT1 及其突变体
• 3 结果
• 3.1 校正后的 IFNgR1CD 及其突变体和截断体双酶切鉴定和测序鉴定结果
• 3.2 Flag-STAT1 及其突变体构建结果
• 第五章 IFNgR 的乙酰化修饰
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 细胞的培养和转染
• 2.2 IP 实验
• 2.3 Western blot 分析
• 2.4 考马斯亮蓝 R-250 染色实验
• 3 结果
• 3.1 IFNgR1FL、IFNgR1CD、IFNgR2FL 与 IFNgR2CD 的乙酰化修饰
• 3.2 准备做质谱的 IFNgR1FL 与 IFNgR2FL 样品的考马斯亮蓝染色结果与质谱初步结果
• 3.3 IFNgR1CD 突变体对其乙酰化的影响
• 第六章 STAT1 的乙酰化修饰
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 细胞的培养和转染
• 2.2 内源 STAT1 乙酰化检测实验
• 2.3 IP 实验方法
• 2.4 Western blot 分析
• 2.5 荧光素酶报告基因活性检测
• 3 结果
• 3.1 IFN-γ 诱导下 Hela 细胞中内源 STAT1 的乙酰化
• 3.2 STAT1 及其突变体乙酰化水平的检查
• 3.3 STAT1 突变体对其形成二聚体的影响
• 3.4 IFN-γ 诱导下 STAT1 突变体转录活性的差异
• 第七章 讨论
• 参考文献
• 第二部分 Survivin 调控的溶瘤腺病毒表达 IL-24 蛋白对人肝癌细胞 PLC 作用机制的探究
• 缩略语
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 流式细胞术检测细胞周期
• 2.3 Western blot 检测 CHOP 表达与 Caspase 剪切水平
• 2.4 Western blot 检测 SCOS3 表达与 STAT3、p38 MAPK 磷酸化水平
• 第三章 结果
• 1 流式细胞术检测细胞周期增殖活性
• 2 Western blot 检测 CHOP 表达与 Caspase12 剪切水平
• 3 Western blot 检测 SCOS3 表达与 STAT3 磷酸化水平
• 4 Western blot 检测 p38 MAPK 磷酸化水平
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章