基于ISSR分子标记的观赏贝母亲缘关系分析

论文摘要

贝母属植物（Fritillaria L.）属百合科,为我国重要药用资源;同时也具有较强的观赏性而用于庭院种植,美化环境,或制作盆景。贝母种类丰富,有潜在和广泛的利用前景。由于贝母属植物分布范围广,种间变异极为复杂,性状交叉普遍,造成其遗传背景复杂。本文采用形态标记和分子标记的方法对观赏贝母材料进行了亲缘关系分析,旨在为观赏贝母优良品种的选育和产业化开发提供理论基础。主要研究结果如下:1.利用形态学标记对13份观赏贝母材料进行了亲缘关系分析。选取了12个数量多态性状和7个质量多态性状,进行生物学特性和物候期观察。聚类分析显示13份材料分为两大类,株高40cm以上的波斯贝母三个品种、皇冠贝母三个品种和展瓣贝母聚在一起,其余株高40cm以下的品种聚在一起。表明株高在此次聚类中占有重要的地位,然后每一类又按小花直径、小花数、花色、花期等进行分类。2.研究了观赏贝母叶片不同保存方法和不同提取方法对DNA提取的影响,结果表明硅胶干燥法可以作为远距离采集贝母叶片时的保存方法,硅胶干燥法提取的总DNA无降解,DNA得率为265.3ug/g左右,纯度（0D260/OD280）在1.8左右。采用改良CTAB法提取的DNA得率最高,为473.6ug/g,DNA纯度较高,0D260/OD280值在1.8左右,并且成本低。可以满足分子标记研究的需要。3.对观赏贝母ISSR反应体系进行了优化,建立了适合观赏贝母ISSR扩增的体系和程序。该反应体系为:在20ul反应体系中,1×PCR buffer,10ng的模板DNA,引物0.5μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,dNTP 0.20mmol·L-1,Taq DNA聚合酶2U。扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性40s,52℃-59℃退火45s,72℃延伸1.5min,循环38次;72℃最后延伸8min,4℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。4.利用ISSR分子标记对22份观赏贝母材料进行了亲缘关系分析。从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰,稳定性好的13条引物共扩增出178个位点,平均每个引物扩增出12个位点,DNA片段大小分布在200-2000bp之间。不同引物扩增的多态性也存在较大的差异,扩增的多态性条带数的范围为7-19条,每个引物检测到的多态位点平均为12.3个。22个观赏贝母品种的相似性系数表明,各基因型间的Jaccard相似系数在0.2338-0.8788之间。通过非加权算术平均数聚类（UPGMA）法,绘制了22个观赏贝母品种遗传关系树状图。以0.50为阈值将22份材料分为2类,第一大类包括比较原始的贝母组和特化的聚花组和单鳞组的贝母;第二大类包括演化水平较高的多鳞组的三种贝母。同一组观赏贝母种质之间表现较近缘的亲缘关系。对比ISSR标记和表型标记聚类发现,两者既有明显的差别也有很多相似之处。ISSR标记直接从分子水平上检测DNA碱基序列的变化,因此更能反映出供试材料间的亲缘关系远近。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 贝母属植物的研究进展
• 1.1 贝母的形态特征与生态习性
• 1.2 贝母属植物的起源、分类与分布
• 1.2.1 贝母属植物的起源与分布
• 1.2.2 贝母属植物的分类
• 1.3 栽培与繁殖
• 1.4 组织培养
• 1.5 贝母的观赏及药用价值
• 2 贝母属亲缘关系的研究概况
• 2.1 亲缘关系研究概述
• 2.1.1 比较形态学方法
• 2.1.2 孢粉学方法
• 2.1.3 数量分类学方法
• 2.1.4 细胞学标记方法
• 2.1.5 生化标记方法
• 2.1.6 分子标记方法
• 2.2 ISSR 标记的原理及在植物中的研究进展
• 2.2.1 ISSR 标记的原理
• 2.2.2 ISSR 在植物遗传多样性和系统进化关系研究中的应用
• 2.2.3 品种鉴定和种质资源收集
• 2.2.4 遗传图谱构建及目的基因标记
• 2.3 贝母属亲缘关系的研究概况
• 2.3.1 比较形态学方法
• 2.3.2 孢粉学方法
• 2.3.3 细胞学标记方法
• 2.3.4 生化标记方法
• 2.3.5 分子标记方法
• 2.4 本课题研究的目的意义
• 第二章 基于形态学特征的观赏贝母亲缘关系研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种植
• 2.2.2 形态性状的选取及编码
• 2.2.3 性状记载
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 基于ISSR 分子标记的观赏贝母亲缘关系分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要生化试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 1.4 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 不同保存方法提取基因组DNA
• 2.2 基因组DNA 提取方法
• 2.2.1 改良CTAB 提取法
• 2.2.2 试剂盒快速提取法
• 2.3 基因组DNA 质量检测
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 质量
• 2.3.2 紫外分光光度计检测基因组DNA 质量
• 2.3.3 用于PCR 的模板制备
• 2.4 ISSR 扩增及扩增产物的检测
• 2.4.1 ISSR 反应体系的建立
• 2.4.2 反应程序的建立
• 2.4.3 ISSR 扩增产物的检测
• 2.5 引物筛选
• 2.6 数据处理与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同保存方法对观赏贝母总DNA 提取效果的影响
• 3.1.1 各样品提取的基因组DNA 的电泳结果
• 3.1.2 各样品提取的基因组DNA 得率和纯度检测
• 3.2 不同提取方法对观赏贝母总DNA 提取效果的影响
• 3.2.1 各样品提取的基因组DNA 的电泳结果
• 3.2.2 各样品提取的基因组DNA 得率和纯度检测
• 3.3 改良CTAB 法对22 份观赏贝母品种基因组DNA 的提取及质量检测
• 3.4 ISSR 反应体系的优化
• 3.4.1 直观分析法
• 3.4.2 方差分析法
• 3.4.3 两种反应体系的比较
• 3.5 ISSR 扩增程序的优化
• 3.5.1 退火温度对ISSR-PCR 的影响
• 3.5.2 循环次数对ISSR-PCR 的影响
• 3.5.3 延伸时间对ISSR-PCR 的影响
• 3.6 引物筛选
• 3.7 ISSR 扩增
• 3.8 聚类结果分析
• 4 讨论
• 4.1 观赏贝母基因组DNA 的提取
• 4.2 观赏贝母ISSR 反应体系的建立
• 4.3 利用 ISSR 分子标记标记进行观赏贝母亲缘关系分析
• 4.4 基于表型聚类和ISSR 标记聚类的比较
• 4.5 建议及展望
• 图版说明
• 参考文献
• 图版I Plate I
• 图版II Plate II
• 图版III Plate III
• 附录一 缩略词表
• 附录二 供试22 份材料间Jaccard 相似系数