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胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物分子生物学研究

2020-12-07阅读(601)

胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物分子生物学研究

论文摘要

葱属植物上病毒病发生普遍,严重影响产量和品质。开展病毒分子生物学研究是了解病害发生过程、制定有效防治策略的基础。本文中,我们首先对引起陕西洋葱黄条症状的病毒进行了鉴定,采用马铃薯Y病毒属（genus Potyvirus）简并引物结合该病毒特异引物扩增并测定了其基因组cDNA全序列（AM267479）;在了解其基因组结构特点的基础上,利用酵母双杂交系统对该病毒及其同属病毒大豆花叶病毒半夏分离物（SMV-P）各编码产物间相互作用关系进行了细致分析;同时,对该病毒P3蛋白与寄主蛋白组分的互作关系也作了较为深入地研究。结果表明,该病毒基因组全序列由10427个核苷酸组成,含有一个编码3, 340氨基酸的开放阅读框。序列分析表明,该病毒与胡葱黄条病毒ZQ2分离物（SYSV-ZQ2）高度相似,核苷酸同一性为93.2%,多聚蛋白的同一性为97.5%,由此推测该病毒为SYSV的洋葱分离物,命名为SYSV-O。这是SYSV侵染洋葱的首次报道。蛋白裂解位点分析发现,除NIb/CP裂解位点外,SYSV-O与SYSV-ZQ2的裂解位点完全一致（NIb/CP裂解位点分别为VSYQ/A和VSYQ/V）。对SYSV分离物基因组3’-末端部分核苷酸序列的系统进化树分析表明,SYSV分离物形成4个明显的群体:印度尼西亚胡葱分离物成簇为一个群体,日本大葱、薤、分葱分离物和一个印度尼西亚大葱分离物成簇为一个群体,中国杭州分葱分离物和中国章丘大葱分离物（ZQ2）成簇为一个群体,中国杭州大葱分离物、章丘大葱分离物（ZQ1）和陕西洋葱分离物成簇为一个群体。分离物间的进化与其寄主植物及地理分布有显著相关性。酵母双杂交技术是研究蛋白质互作的有效工具,在目前Potyvirus属病毒的研究中,人们已经利用该技术发现了一些病毒编码蛋白的互作,然而对于Potyvirus属病毒编码的全部蛋白之间存在怎样的互作关系还不明确。本文对此开展了部分工作,绘制了两种Potyvirus属病毒（SYSV-O和SMV-P）编码蛋白间的互作图谱。结果表明,SYSV-O P1蛋白可以自身互作,同时与P3、6K1、CI、VPg、NIa-pro、CP存在互作;Hc-Pro可以自身互作,同时与P3、NIa-pro、VPg、CP互作;P3蛋白可以自身互作,还可与除CP之外的所有病毒蛋白互作;6K1和6K2都可以和P3、VPg、NIa-pro互作;CI存在自身互作,还与P1、P3、6K2、VPg、NIa-pro互作;VPg可以自身互作,同时与除NIa-pro和CP之外的其他蛋白都互作;NIa-pro可以自身互作,也和除了VPg之外的其他蛋白互作;NIb也可自身互作,同时还与VPg、NIa-pro和CP互作;CP蛋白可自身互作,还可与P1、Hc-Pro、CI、VPg、NIa-pro、NIb互作。SMV-P编码蛋白的互作与SYSV-O有相同之处,但也有其特有的互作。这些互作中很多都和以前在Potyvirus属成员中的研究结果相一致,但是6K1、6K2与其他蛋白的互作以及P1、P3、NIb的自身互作均为首次发现。病毒编码蛋白之间的互作有方向性,这种互作的方向性可能是不同载体在酵母细胞中有各自喜好的折叠方式或暴露的结合位点不同而造成的。其中两个病毒中都存在而且在不同的方向都能检测到的互作只有6K1/NIa-pro组合。检测到3组两个病毒的HC-Pro和对方病毒编码蛋白的互作:SMV-P-HC-Pro/ SYSV-O-NIa-pro, SYSV-O-HC-Pro/ SMV-P-NIa-pro, SYSV-O-HC-Pro/SMV-P-NIb,认为这种不可能的互作是由于两个病毒同类编码蛋白之间的同源性而产生的。SYSV-O与同属洋葱黄矮病毒（OYDV）基因组结构相似,也编码一个大的P3蛋白,然而目前对于其功能尚不清楚。本文利用酵母双杂交技术筛选到P3的寄主互作蛋白,初步分析了P3可能的功能及作用机制。结果表明,SYSV-O P3与洋葱1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）大亚基（rbcL）具有强烈的互作反应,Rubisco是植物光合作用中的关键酶,说明P3蛋白可能通过影响寄主植物的光合作用参与症状表现过程。克隆洋葱rbcL全长基因后,利用酵母双杂交系统和免疫共沉淀试验进一步证实了两者间的互作。缺失突变体分析发现,rbcL N端结构域是与P3互作的关键区域,而P3的互作区域可能位于膜外部分的N端。在其他编码蛋白和其他病毒上的试验表明,OYDV-P3和SMV-P-P3也可与rbcL互作,并且SYSV-O的8个蛋白（除了6K1和CP）和SMV-P的7个蛋白（除了6K1, CI和CP）与rbcL也存在互作,表明potyvirus属成员的P3蛋白与rbcL的互作关系是普遍存在的;potyvirus属病毒的多种编码蛋白可能都不同程度地参与了寄主症状的表达。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 葱属植物病毒病的研究进展
  • 1.2 Potyvirus 属病毒的分类标准
  • 1.3 Potyvirus 属病毒编码蛋白功能
  • 1.3.1 非编码区
  • 1.3.2 P1 蛋白
  • 1.3.3 HC-Pro
  • 1.3.4 P3 蛋白
  • 1.3.5 6K 蛋白
  • 1.3.6 CI 蛋白
  • 1.3.7 NIa 蛋白
  • 1.3.7.1 NIa-pro 蛋白
  • 1.3.7.2 NIa-VPg 蛋白
  • 1.3.8 NIb 蛋白
  • 1.3.9 CP 蛋白
  • 1.4 研究Potyvirus 属成员病毒蛋白功能常用技术
  • 1.4.1 酵母双杂交系统
  • 1.4.2 转基因技术
  • 1.4.3 全长cDNA 侵染性克隆
  • 1.4.4 双分子荧光互补
  • 1.4.5 串联亲和纯化
  • 1.5 本研究的目的和意义
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 试剂与仪器
  • 2.1.1 试剂
  • 2.1.2 仪器
  • 2.2 材料
  • 2.2.1 病样和转基因材料
  • 2.2.2 菌株和载体质粒
  • 2.3 方法
  • 2.3.1 普通生物学实验方法
  • 2.3.1.1 病毒提纯
  • 2.3.1.2 电子显微镜观察
  • 2.3.2 分子生物学实验方法
  • 2.3.2.1 RNA 抽提
  • 2.3.2.2 逆转录
  • 2.3.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
  • 2.3.2.4 DNA 片段切胶纯化
  • 2.3.2.5 T-A 连接
  • 2.3.2.6 感受态细胞制备（CaC12 法）
  • 2.3.2.7 转化和筛选
  • 2.3.2.8 质粒提取
  • 2.3.2.9 序列测定和分析
  • 2.3.3 血清学实验方法
  • 2.3.3.1 原核表达载体构建
  • 2.3.3.2 目的蛋白纯化
  • 2.3.3.3 抗血清的制备
  • 2.3.3.4 Western Blot
  • 2.3.4 酵母双杂交实验方法
  • 2.3.4.1 基本操作
  • 2.3.4.2 SMV-P 和SYSV-O 蛋白互作
  • 2.3.4.3 洋葱文库构建和筛选
  • 2.3.5 拟南芥转基因
  • 2.3.5.1 拟南芥的培养
  • 2.3.5.2 拟南芥转基因
  • 2.3.5.3 转基因植株检测
  • 第三章 胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物基因组全序列测定及分析
  • 3.1 SYSV 研究现状
  • 3.1.1 普通生物学
  • 3.1.1.1 寄主范围和危害症状
  • 3.1.1.2 传播方式
  • 3.1.1.3 病毒粒子形态和细胞病理学特征
  • 3.1.1.4 血清学关系
  • 3.1.2 分子生物学研究进展
  • 3.2 胡葱黄条病毒陕西洋葱分离物基因组的全序列测定及分析
  • 3.2.1 电镜观察
  • 3.2.2 SYSV-O 基因组全序列测定
  • 3.2.3 SYSV-O 基因组分析
  • 3.2.3.1 SYSV-O 基因组结构特征
  • 3.2.3.2 SYSV-O 基因组序列分析
  • 3.3 SYSV-O 与相关病毒的血清学关系
  • 3.3.1 SYSV-O CP 的原核表达
  • 3.3.1.1 构建SYSV-O CP 的原核表达载体
  • 3.3.1.2 原核表达产物的SDS-PAGE 分析
  • 3.3.2 SYSV-O CP 抗血清制备及检测
  • 3.3.3 SYSV、LYSV 和OYDV 的血清学关系
  • 第四章 酵母双杂交分析SYSV-O 和SMV-P 编码蛋白的相互作用
  • 4.1 SYSV-O 和SMV-P 各基因酵母双杂交载体的构建
  • 4.1.1 引物设计
  • 4.1.2 构建SYSV-O 的诱饵质粒和猎物质粒
  • 4.1.3 诱饵质粒和酵母质粒在酵母中的表达
  • 4.1.4 单个酵母双杂交质粒的自激活检测
  • 4.2 酵母双杂交分析SYSV-O 和SMV-P 编码蛋白的互作图谱
  • 4.2.1 互作图谱的建立
  • 4.2.2 SMV-P-HC-Pro 与SYSV-O 编码蛋白以及SYSV-O-HC-Pro 与SMV-P 编码蛋白之间的互作检测
  • 4.2.3 假阳性的排除
  • 4.2.4 缺失的SMV-P 6K1 与NIa-pro 之间的互作
  • 4.3 讨论
  • 第五章 SYSV-O P3 蛋白功能的研究
  • 5.1 YTHS 筛选与SYSV-O P3 蛋白互作的洋葱蛋白
  • 5.1.1 洋葱总RNA 提取以及LD-PR
  • 5.1.2 共转化筛选与SYSV-O P3 蛋白互作的洋葱蛋白
  • 5.1.3 阳性克隆的进一步验证
  • 5.1.4 测序结果与分析
  • 5.2 YTHS 验证rbcL/SYSV-O-P3 的互作
  • 5.2.1 洋葱rbcL 全序列
  • 5.2.2 用完整的O-rbcL 的ORF 构建酵母双杂交载体
  • 5.2.3 YTHS 再证明完整的O-rbcL 蛋白和SYSV-O-P3 有互作
  • 5.2.4 YTHS 证明rbcL 和OYDV-P3、SMV-P-P3 之间存在互作
  • 5.2.5 缺失突变确定rbcL/SYSV-O-P3 互作区域
  • 5.2.6 缺失突变确定rbcL/OYDV-P3 互作区域
  • 5.3 免疫共沉淀进一步验证rbcL/SYSV-O-P3 的互作
  • 5.3.1 rbcL 抗血清的制备
  • 5.3.2 构建体外表达载体pTNT-rbcL 和pTNT-SYSVO-P3?2
  • 5.3.3 免疫共沉淀证明rbcL/SYSV-O-P3 体外互作
  • 5.4 rbcL 和拟南芥 Rieske FeS 与 SYSV-O 和 SMV-P 其它编码蛋白的互作研究
  • 5.4.1 rbcL 与SYSV-O 和SMV-P 其它编码蛋白的互作研究
  • 5.4.2 拟南芥Rieske FeS 与SYSV-O 和SMV-P 其他编码蛋白的互作研究
  • 5.5 SYSV-O-P3 转拟南芥研究
  • 5.5.1 SYSV-O-P3 转基因载体构建
  • 5.5.2 转SYSV-O-P3 拟南芥的分子鉴定
  • 5.5.3 激光共聚焦显微镜观察GFP 融合蛋白在拟南芥中的表达
  • 5.6 讨论
  • 第六章 结论与进一步的研究建议
  • 6.1 主要结论
  • 6.2 进一步的研究设想
  • 参考文献
  • 附录1（表格）
  • 附录2（图）
  • 英文缩略词
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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