甘蓝SI决定因子的原核表达和相互作用研究以及SI相关基因的探讨

论文摘要

自交不亲和（self-incompatibility,SI）是一个广泛存在于被子植物中古老的遗传性状。植物体通过漫长的进化形成了有利于异花授粉的SI遗传机制,使显花植物避免近亲繁殖和自交衰退,有利于保持物种的多样性和独立性,为物种的生存和发展提供了有力的保障。在甘蓝中,柱头对花粉的识别决定于S位点的两个紧密连锁同时呈现高度多态性的基因:①S位点富含半胱氨酸基因（S locus cysteine-rich protein,SCR）,又称为S位点蛋白质11基因（S-locus protein11,SP11）,该基因编码一个位于花粉外壳的小分子极性亲水性蛋白。通过突变体分析、序列比对、转基因和授粉鉴定等一系列的证据表明它就是雄性决定因子。②S位点受体激酶基冈（S locus receptor kinase,SRK）编码一个跨膜的丝氨酸/苏氨酸受体激酶,该激酶位于柱头乳突细胞膜上,富含糖基化位点的N端S区域突出于细胞膜外,C端丝氨酸/苏氨酸激酶区整合于细胞膜内。它作为自交不亲和信号传导的雌性决定因子,决定柱头特异的S基因型并传递自交不亲和信号。同一等位S基因型的SRK与SCR相互作用是诱发自交不亲和信号传导途径的第一步,启动了整个自交不亲和信号传导途径。具有自交不亲和性的甘蓝在自花授粉后,当花粉黏附到柱头上,花粉携带的可扩散SCR信号分子就被转运到柱头表面,通过进一步的扩散与位于乳突细胞原生质膜上的SRK信号受体相互作用。SRK接收信号后被激活,引起细胞内信号的级联反应,并最终抑制花粉的萌发。在复杂的SI信号传递网络中,目前已经确定的参与自交不亲和信号传导的因子只有SRK,SCR,THL1,THL2,ARC1和MLPK,还有很多信号因子没有被发现。2003年,吴能表通过32P标记放射自显影从自交不亲和植物中获得一特异的未知磷酸化蛋白,推测为授粉引发的自交不亲和相关因子,并有可能作为自交不亲和信号传导的下游因子,为自交不亲和性的分子机理研究提供新的研究内容。本研究以高度自交不亲和性结球甘蓝ZQ为材料,克隆了自交不亲和信号传导中的雌雄决定因子,并进行了体外表达分析,建立了适用于SRK与SCR相互作用的体外检测体系,为进一步的化学调控试剂的筛选,实现SRK-SCR复合体聚合与解离的人为调控提供理论和技术基础。同时为编码基因的定点突变以及使用大规模蛋白质相互作用的研究方法如酵母双杂交、质谱鉴定、蛋白芯片以及基于生物信息学的分析方法,深入研究SRK与SCR相互作用的机理提供了一个相互作用体系的技术平台。另外选用结球甘蓝高度自交不亲和性材料E1设计兼并引物结合3’-RACE对自交不亲和相关基因进行筛选和分析,以期为自交不亲和未知的下游信号的分离和鉴定提供新的信息与线索。主要工作及结果总结如下:1.S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11（SCR/SP11）编码区的克隆及表达采用巢式RT-PCR,以甘蓝ZQ的花药cDNA为模板,扩增了ZQ的SCR序列。SCRfZQ序列分析结果表明ZQ材料的S基因型是属于甘蓝S28单倍型。按已知S单倍型的分类分析,ZQ属于第Ⅰ类S单倍型,具有高度的自交不亲和性,这与田间检测的自交亲和指数为0.004结论一致。进一步的编码区克隆子SCRZQ序列分析表明:SCRZQ编码SCRZQ蛋白信号肽C端的三个氨基酸VEA和成熟肽,预测编码蛋白大小为7.8kD。编码的64个氨基酸中包含有SCR蛋白家族中保守的8个半胱氨酸和1个甘氨酸特征型氨基酸位点,另外还含有2个不保守的半胱氨酸。对这10个半胱氨酸形成的二硫键的分析表明,除保守的Cys57不能形成蛋白内二硫键,其余保守半胱氨酸均形成了蛋白内二硫键以稳定SCRZQ的蛋白构型。三维结构的分析表明SCRZQ蛋白呈皱缩螺旋状,包含一个α-螺旋和三个反向平行的β-片层。SCRZQ经转化酶切及连接后构建出融合表达载体pET43.1a-SCRZQ,并诱导获得了大小约为74kD的Nus·A-SCR融合表达蛋白。通过正交设计,定量分析各表达蛋白所得的校正相对光强值,SCRZQ在各诱导条件下均有高表达量,其中各表达因素对融合蛋白的表达量影响均未达到显著水平。SCRZQ表达菌液经蛋白纯化试剂盒处理后,能得到明显无杂带的纯化蛋白。2.S位点受体激酶胞外域编码区（mSRK）的克隆及表达2.1 S位点受体激酶胞外域编码区（mSRK）的克隆及序列分析在甘蓝ZQ柱头中成功克隆出mSRK长度为1319bp的cDNA序列,核苷酸序列的比对分析与SCRfZQ序列比对分析结果一致:ZQ材料的S基因型与甘蓝的S28基因型序列完全一致,其次与油菜的S54亲缘关系很近。mSRK编码的氨基酸序列分析,推导编码氨基酸439个,编码蛋白大小49.3 kD。前16个疏水性氨基酸为信号肽序列,最后10个氨基酸为跨膜域序列,中间含有作为S多基因家族标志的12个保守的半胱氨酸。另外还含有6个N-糖基化位点及多个活性位点。mSRK编码蛋白高级结构分析结果表明:mSRK包含了B-Lectin结构域,SLG结构域以及PANAPPLE结构域。其中PANAPPLE结构域中三个极性氨基酸位点P（350）,T（352）,R（369）推测为蛋白或糖的结合位点。对mSRK蛋白分区建模,获得两个mSRK 3D模型。模型1对应mSRK蛋白第14位至264位氨基酸,包含了B-Lectin结构域和部分SLG结构域,形成了如海马状构型,含有两个12股β-棱状Ⅱ折叠和海马腹部一小段连接区域。模型2对应mSRK蛋白第285至391位氨基酸,覆盖了部分SLG结构域及PAN APPLE结构域。主要由1个α-螺旋和5个β-片层构成,含有12个保守的半胱氨酸和推测的3个蛋白或糖的结合位点。进一步的功能位点预测,保守性较高的氨基酸功能活性位点集中在mSRK蛋白中的半胱氨酸位点上,由此推测mSRK蛋白中半胱氨酸有重要的生物学功能。12个半胱氨酸中保守的有10个半胱氨酸被预测到可以形成五对蛋白内的二硫键,而另外两个半胱氨酸Cys366和Cys370或是保持自由状态,或者是与其它蛋白中的半胱氨酸残基配对形成二硫键。2.2 S位点受体激酶胞外域编码区（mSRK）的原核表达本研究构建了两种形式的mSRK的原核表达载体。pET43.1a-Nus·A-mSRK表达载体中含有Nus·A融合肽,用于增加mSRK在大肠杆菌中的可溶性表达量和表达活性,有利于进一步分析它与SCR蛋白的相互作用。而去除了Nus·A融合肽的pET43.1a-mSRK表达载体的构建,主要是排除Nus·A融合肽中含有的His标签在相互作用检测系统中可能造成的假阳性影响,作为Nus·A-mSRK蛋白与SCRZQ蛋白相互作用验证的重要补充。将构建的pET43.1a-Nus·A-mSRK与pET43.1a-mSRK表达载体在大肠杆菌BL21中成功表达,分别表达出大小约为112.0kD和50.0kD的目的蛋白。在Nus·A-mSRK原核表达中表达温度对蛋白表达量的影响极显著,最佳诱导表达条件为:温度25℃;IPTG浓度0.1 mmol·L-1;时间1h。mSRK受表达条件影响不显著。通过超声破碎裂解表达菌液,加入Ni+磁珠回收目的蛋白,获得了纯化的Nus·A-mSRK蛋白。3.SCRZQ与mSRK蛋白相互作用的体外检测利用SCRZQ融合表达蛋白上的组氨酸标签能与Ni+磁珠螯合,将SCRZQ融合表达蛋白分别与构建的两套原核表达系统pET43.1a-mSRK/pET43.1a-Nus·A-mSRK的诱导表达蛋白及Ni+磁珠在适宜于mSRK与SCRZQ相互作用的蛋白提取液里孵育2h,洗涤纯化后,对纯化复合物进行SDS-PAGE检测,我们验证了mSRK蛋白与SCRZQ蛋白在体外是能够相互结合,形成了稳定的结合复合物。同时也说明mSRK蛋白与SCRZQ蛋白在体外的相互作用并不是产生于瞬间的结合。4.授粉引发的甘蓝SI相关基因的探讨根据吴能表发现的磷酸化蛋白的N端氨基酸序列设计兼并引物进行3’-race扩增,然后对所得核酸序列进行编码氨基酸的分析,我们筛选候选基因并进行EST序列的电子拼接。分析扩增得到的六条序列,均不符合编码这个磷酸化蛋白N端序列。但是同时,我们发现了一条新序列并命名为NG,目前在其它物种中未找到与之同源的序列,只是在甘蓝的EST数据库中找到可以拼接的序列表达标签。NG按照分析出的可读框,编码的氨基酸序列与拟南芥热激蛋白相关因子有较高的同源性。初步的RT-PCR检测表明NG基因在柱头有高量表达,在叶片中微量表达,花药,花茎和根中均无表达。然后我们将NG序列按照推测的编码框设计引物,扩增编码区后连接到pET43.1a表达载体上,构建了pET43.1a-NG表达载体。在大肠杆菌BL21中成功诱导表达并纯化出约91.2kD的目的融合蛋白,以利于新序列NG推测编码蛋白的功能研究。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 孢子体型自交不亲和性研究进展

1.1.1 SSI自交不亲和性的信号传导

1.1.2 自交不亲和信号传导的编码元件

1.1.3 自交不亲和的信号传导模型

1.2 SI决定因子的鉴定及结构与功能的研究进展

1.2.1 SI雌性决定因子—SRK

1.2.2 SI雄性决定因子—SCR

1.2.3 SRK与SCR的相互作用研究

1.3.RACE技术在植物新基因克隆上的应用

1.3.1 RACE原理

1.3.2 RACE技术的优势与局限

1.3.3 RACE技术的改良

1.3.4 新型的RACE技术

1.3.5 RACE技术的应用现状及发展前景

1.4 Novagen pET表达系统的简介

1.4.1 pET载体的类型

1.4.2 载体的选择和融合标签的介绍

1.4.3 制备不带融合标签的天然蛋白

1.4.4 用于表达的菌株

引言

第二章甘蓝SCR/SP11的克隆及其体外表达

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒与菌株

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 工具酶和主要分子生物学试剂盒

2.1.5 培养基和其他试剂

2.2 方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 cDNA第一链合成

2.2.3 引物设计

2.2.4 SCR基因cDNA PCR扩增

2.2.5 目的片段克隆

2.2.6 测序与序列分析

ZQ在大肠杆菌BL21中表达'>2.2.7 SCR_ZQ在大肠杆菌BL21中表达

2.2.8 表达产物纯化

2.3 结果与分析

2.3.1 甘蓝花药总RNA的提取

2.3.2 SCR基因克隆与序列分析

ZQ表达质粒构建与鉴定'>2.3.3 SCR_ZQ表达质粒构建与鉴定

ZQ在大肠杆菌BL21中诱导表达'>2.3.4 SCR_ZQ在大肠杆菌BL21中诱导表达

2.4 本章小结

第三章甘蓝SRK胞外域编码区的克隆及表达

3.1 材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 质粒与菌株

3.1.3 工具酶及主要的分子生物学试剂盒

3.1.4 培养基及其他试剂

3.2 方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 mSRK基因cDNA-PCR扩增

3.2.3 目的片段克隆

3.2.4 测序与序列分析

3.2.5 mSRK在大肠杆菌BL21中表达

3.2.6 Nus·A-mSRK表达产物的纯化

3.3 结果与分析

3.3.1 甘蓝ZQ柱头总RNA的提取

3.3.2 mSRK1基因克隆与序列分析

3.3.3 mSRK2序列的克隆

3.3.4 mSRK表达质粒的构建与建立

3.3.5 mSRK在大肠杆菌BL21中的诱导表达

3.3.6 Nus·A-mSRK融合蛋白的纯化

3.4 小结

第四章甘蓝SI决定因子相互作用的体外检测

4.1 材料

4.2 方法

ZQ制备'>4.2.1 诱饵蛋白SCR_ZQ制备

4.2.2 靶蛋白SRK溶液制备

ZQ与SRK相互作用检测'>4.2.3 SCR_ZQ与SRK相互作用检测

4.3 结果与分析

ZQ和Nus·A-mSRK相互作用的体外检测'>4.3.1 SCR_ZQ和Nus·A-mSRK相互作用的体外检测

ZQ和mSRK相互作用的体外检测'>4.3.2 SCR_ZQ和mSRK相互作用的体外检测

4.4 小结

第五章授粉引发的甘蓝SI相关基因的探讨

5.1 材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 质粒与菌株

5.1.3 工具酶及主要的分子生物学试剂盒

5.1.4 培养基及其他试剂

5.2 方法

5.2.1 引物设计

5.2.2 基因克隆

5.2.3 目的片段的回收转化

5.2.4 测序与序列分析

5.2.5 NG在甘蓝不同组织的RT-PCR表达分析

5.2.6 NG在大肠杆菌BL21中表达

5.3 结果与分析

5.3.1 兼并引物的3'-race扩增

5.3.2 扩增产物序列分析与筛选

5.3.3 NG在甘蓝不同组织的RT-PCR表达分析

5.3.4 NG在大肠杆菌BL21中体外表达分析

5.4 本章小结

第六章讨论

ZQ与mSRK序列与结构分析'>6.1 SCR_ZQ与mSRK序列与结构分析

6.2 Nus·A融合蛋白表达系统

6.3 mSRK两种pET表达载体的构建

ZQ与mSRK相互作用分析及构建平台运用'>6.4 SCR_ZQ与mSRK相互作用分析及构建平台运用

6.5 授粉引发SI相关基因的探讨

6.6 新序列NG的初步研究

第七章结论与创新点

参考文献

缩略词表

致谢

在学期间发表文章情况

甘蓝SI决定因子的原核表达和相互作用研究以及SI相关基因的探讨

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