论文摘要
研究背景大量研究试图寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物,并且已经在动物模型上获得一定成功,但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注可预期的情况下。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法,然而再灌注也可能加重损伤。许多研究发现,在再灌注早期,大量活性氧自由基产生和钙超载导致了缺血再灌注损伤。近期研究提示,在冠状动脉再灌注开始时,反复的短暂再灌注和再阻断具有内在的保护作用,这一现象称为“缺血后适应”。由于突然发生的缺血很难预测,而缺血后适应发生在缺血后,因此受到广泛关注。临床有很多情况可以导致全脑缺血,如淹溺、心搏骤停及大血管和心脏手术中的严重低血压等,而脑比其他器官对缺血更敏感。最近,一些实验结果显示,大鼠缺血后适应可减小局灶性脑缺血再灌注后梗死面积,减轻全脑缺血再灌注损伤和脊髓缺血后损伤,然而其分子机制尚未完全清楚。本实验首先改良Pulsinelli四血管阻塞大鼠全脑缺血模型,利用此改良模型评估缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨其可能机制。第一部分大鼠四血管阻塞全脑缺血模型的改良目的:改良四血管阻塞法大鼠全脑缺血模型,以提高模型的成功率。方法:100只雄性SD大鼠随机分为2组:组Ⅰ:Pulsinelli法四血管阻塞模型;组Ⅱ:改良四血管阻塞模型。组Ⅰ大鼠椎动脉永久性电凝阻断,双侧颈总动脉游离备用,第二日,直视下用动脉夹夹闭颈总动脉10min造成短暂脑缺血。组Ⅱ大鼠模型进行了改进:双侧颈总动脉游离后,分别用15cm长的10号外科丝线一端经椎旁间隙穿出到颈后,另一端绕过同侧颈总动脉经胸锁乳突肌和颈外静脉间隙穿出至颈后,固定后备用。第二日在颈部收紧丝线阻断颈总动脉10min造成短暂脑缺血。模型成功的标准采用临床指标:翻正反射完全、持续消失,对非伤害性刺激无反应。为了鉴别模型失败的原因,对不成功的大鼠进行全脑血管DSA。结果:①与组Ⅰ相比,组Ⅱ符合模型成功标准的大鼠显著增加,两组因呼吸衰竭、肺水肿和惊厥而剔除的大鼠没有统计学差异;②两组椎动脉烧灼失败率没有统计学差异。结论:改良四血管阻塞大鼠全脑缺血模型可提高模型的成功率而不增加并发症。第二部分:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注的保护作用。方法:43只雄性SD大鼠随机分为3组:sham组（12只,假手术组）、I/R组（16只,缺血10min再灌注组）和Postcond组（15只,缺血10min后,在再灌注早期行后适应处理,即灌注30s再阻断10s,如此3个周期）。再灌注24h后,每组5只大鼠被断头取脑,左脑用干湿重法计算脑水含量。右侧海马检测MDA和SOD活性。每组7只大鼠再灌注72h后进行Nissl染色观察海马CA1区神经元破坏程度。结果:①I/R组有4只（其中1只因呼吸衰竭,3只因惊厥）剔除出实验,Postcond组有3只（其中1只因呼吸衰竭,2只因惊厥）剔除出实验,I/R组与Postcond组相比差异无显著性（P＞0.05）;②脑组织水含量的测定结果表明,全脑缺血再灌注后脑组织的含水量都明显升高（P＜0.05）,但是Postcond组较I/R组脑水含量少（P＜0.05）;③与sham组相比,全脑缺血再灌注后海马中的SOD活性均有不同程度的降低（P＜0.05）,I/R组降低更为显著（P＜0.05）,与sham组比较,全脑缺血再灌注后海马中MDA含量明显增高（P＜0.05）,而I/R组增高更为显著（P＜0.05）;④Sham组海马细胞核膜完整,核仁清楚,偶可见退变锥体细胞。I/R组再灌注3日后,在CA1区可观察到大量退变神经元;与I/R组相比,Postcond组海马CA1区退变神经元明显减少（P＜0.05）。结论:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤具有保护作用,可减少海马神经元的破坏。其保护作用可能与抑制脂质过氧化有关。第三部分:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经行为学的影响目的:通过神经损害评分（NSS）和Morris水迷宫研究缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后近期及远期神经行为学的影响。方法:96只雄性SD大鼠随机分为3组（同第二部分）。于再灌注后6h、12h、24h、48h及96h进行NSS评分。分别于再灌注后5日及28日开始,每组各取16只分别进行水迷宫实验评价大鼠的空间学习和记忆能力。结果:①与sham组相比,I/R组和Postcond组NSS评分增加,但是Postcond组增加较少（P＜0.05）;②水迷宫实验结果方差分析显示,I/R组和Postcond组有认知障碍,I/R组更明显（P＜0.05）,在同一实验日期,Postcond组平均潜伏期较I/R组短（P＜0.05）。结论:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤引起的近期和远期认知障碍有保护作用。第四部分:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响目的:研究缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡的影响及caspase-3和bcl-2在其中的作用机制。方法:45只雄性SD大鼠随机分为3组（同第二部分）。再灌注后72h每组5只大鼠生理盐水、多聚甲醛灌注后端头取脑,用TUNEL染色法计算各组海马CA1区凋亡的神经元个数。再灌注后24h时每组5只大鼠生理盐水、多聚甲醛灌注后断头取脑行免疫组织化学检测海马CA1区caspase-3和bcl-2蛋白的表达,另每组各取5只大鼠深麻醉下断头取脑,分离海马,行Western-Blot检测caspase-3和bcl-2蛋白的表达。结果:①再灌注后72h时,I/R组与Postcond组神经元凋亡增多,I/R组更严重（P＜0.05）;②I/R组和Postcond组于缺血再灌注后24h可见caspase-3和bcl-2表达增高,与I/R组相比,Postcond组caspase-3表达更低,而bcl-2表达更高（P＜0.05）。结论:缺血后适应可减轻神经细胞凋亡,caspase-3与bcl-2可能参与了其机制。第五部分:缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马区炎症反应的影响目的:研究缺血后适应对大鼠全脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响及可能机制。方法:75只雄性SD大鼠随机分为3组（同第二部分）。再灌注24h,每组5只大鼠深麻醉下断头取脑,分离海马,用MPO试剂盒检测海马MPO活性,凝胶电泳迁移率实验（EMSA）检测海马NF-KB的DNA结合活性。分别于再灌注后0h、4h、12h、24h及72h每组各取5只大鼠深麻醉下断头取脑,分离海马,行Real-Time PCR检测海马TLR4基因mRNA的表达。结果:①缺血后适应对全脑缺血再灌注后海马MPO活性、NF-KB的DNA结合活性的升高有抑制作用;②Real-Time PCR结果显示:缺血再灌注后各时间点TLR-4基因mRNA表达上调,24h达高峰,缺血后适应对TLR-4基因mRNA表达上调具有明显的抑制作用。结论:缺血后适应可抑制大鼠全脑缺血再灌注损伤后MPO活性和NF-KB的DNA结合活性,并抑制TLR4基因mRNA的上调,其对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与减轻炎症反应有关。