猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及初步应用

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）等相关疾病的主要病原之一。PMWS是继猪繁殖与呼吸综合征之后出现的又一猪免疫抑制性疾病,其流行广泛及造成的巨大经济损失,已引起世界养猪业的重视。目前尚无切实可行的商品疫苗和药物来防制PMWS的发生,因此,为了更好地预防和监控猪圆环病毒病,建立一种血清学检测PCV2的方法,以掌握该病的流行情况是十分必要的。根据PCV的抗原性和基因组成不同,可分为PCV1和PCV2两型,PCV1无致病性,PCV2具有致病性。其共有的开放性阅读框架ORF1相对保守,ORF1编码Rep蛋白的抗原性十分相近,氨基酸的同源性达86%,因此,两型病毒之间存在抗原交叉性。而PCV1与PCV2共有的ORF2基因编码病毒的主要结构蛋白（Cap蛋白）,在两型病毒间氨基酸同源性较低仅为65%,不存在交叉反应,具有较好的免疫原性,可作为区分PCV1与PCV2的重要蛋白。这对猪圆环病毒病的诊断与疫苗研究有较大的意义。间接ELISA方法具有很高的敏感性和特异性,结果判定快速且易于标准化。本实验利用ORF2部分基因的原核表达蛋白,作为诊断抗原,建立间接ELISA方法,应用于临床检测PCV2血清抗体。全长ORF2基因在大肠杆菌中的表达具有表达量低或不表达的缺陷,因此,我们利用PCV2 ORF2内含的EcoRI酶切位点,及载体上含有的XhoI酶切位点,从已构建的克隆质粒pMD-ORF2上切除含5′端核定位信号区域,将截短的ORF2基因片段克隆到pGEX-6P-1表达载体上,经酶切鉴定,证明成功构建了阳性重组表达质粒pGEX-ORFc。将重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态BL21中,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测及Western-blot分析结果表明,重组融合蛋白表达量高,且能够被PCV2标准阳性血清所识别,具有一定的反应原性。利用IPTG诱导表达重组菌pGEX-ORFc/BL21,重组蛋白表达产物以包涵体形式存在于菌体中,进行超声波裂解菌体,包涵体洗涤、溶解及尿素梯度透析复性,最后电洗脱法纯化重组蛋白,获得了理想的纯化效果。利用纯化的重组蛋白作为抗原包被酶标板,通过对各项反应条件的摸索、优化,确定了最适工作条件,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果为,抗原最佳包被浓度为12.85 ug/mL,最佳包被条件为37℃放置2 h后4℃包被过夜,0.5%BSA/PBST作为封闭液,37℃封闭2 h,待检血清稀释度为1:40,37℃作用1h,HRP-兔抗猪IgG稀释1:1000,37℃反应45 min,底物作用至显色,加入终止液终止反应,阴阳性临界值为0.39。利用该方法对吉林省猪场进行大规模血清学检测,检测179份临床血清样品,检出总阳性率为42.5%。结果表明,本实验建立的间接ELISA检测方法敏感度高、特异性强,可用于临床PCV2血清抗体的检测。这为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PCV2感染的快速诊断方法提供了科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 病原学
• 2 分子生物学
• 3 流行病学
• 4 致病机理
• 5 临床症状与病理变化
• 6 诊断技术研究
• 7 防制
• 8 实验目的与意义
• 实验部分
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介