论文摘要
目的:研究疏肝健脾法对肝干细胞增殖、诱导分化作用、促进肝再生及调控机制,探索疏肝健脾法治疗慢性肝病的作用原理,为进一步研究治则治法提供新思路。方法:1.疏肝健脾法对肝干细胞增殖的影响:取对数生长期细胞用胰酶消化,接种于96孔细胞培养板,细胞贴壁后同步化24小时,分为正常对照组,空白对照组,疏肝健脾药物血清5%组、10%组、20%组,疏肝药物血清5%组、10%组、20%组,健脾药物血清5%组、10%组、20%组,作用24小时后采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）测定细胞的增殖状况。2.疏肝健脾法对肝干细胞HGF、EGF、FGF、TGF-β和CTGF受体表达分子机制研究:分为正常对照组、空白对照组、疏肝健脾组、疏肝组和健脾组,10%药物血清浓度作用细胞24小时后,裂解细胞,提取细胞的总蛋白,蛋白印迹法（Western blot）测定各组的HGF、EGF、FGF、TGF-β和CTGF受体蛋白表达情况。3.疏肝健脾法对肝干细胞体外诱导、分化作用研究:取5×103/孔WB-F344细胞接种于细胞培养板,8h后换分化培养体系（高糖DMEM、体积分数10%胎牛血清、HGF50ng/ml、EGF20ng/ml、胰岛素1μg/ml、地塞米松1μmol/L）,并加入10%疏肝健脾药物血清,同时设单纯培养体系对照孔。连续培养,于0、7、10、14、21d分别收集分化培养细胞,提取总RNA,RT-PCR法检测干细胞标志物甲胎蛋白（AFP）及肝细胞标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达,观察疏肝健脾法刺激肝干细胞向肝细胞分化的效应。4.疏肝健脾法对肝干细胞抗凋亡作用研究:调整1×106细胞置于培养板,37℃6h,细胞贴壁后加入40ng/ml浓度TGF-β,分为正常对照组、空白对照组、疏肝健脾组、疏肝组和健脾组进行试验。作用24h后,分别用Annexin V-FITC和PI染色,流式细胞仪测定。观察对TGF-β诱导干细胞凋亡的药物拮抗作用。5.疏肝健脾法对大鼠肝干细胞增殖及肝脏再生的机制研究:分为正常对照组、模型组、疏肝健脾组、疏肝组和健脾组,运用2-AAF加三分之二肝切除（2/3PH）法制作大鼠肝干细胞增殖模型;免疫组化法观察各组CK、PCNA、波形蛋白、AFP、ALB的表达,进行模型评价;免疫组化法观察各组HGF、EGF、FGF、TGF-β和CTGF受体表达,研究疏肝健脾法的作用机制。结果:1.疏肝健脾法对肝干细胞增殖的影响:含药血清刺激组与空白对照组相比OD值显著升高（P＜0.01）,含药血清能显著刺激WB-F344细胞增殖;不同浓度含药血清干预组与血清干预组相比OD值均升高,且均有显著性差异（P＜0.05）,提示高、中、低浓度的含药血清均能刺激WB-F344细胞的增殖;且以高浓度的含药血清刺激增殖的作用最强,呈一定的量效关系;各浓度的含药血清均未表现出对WB-F344细胞的毒性作用。2.疏肝健脾法组肝干细胞WB-F344HGF、EGF、CTGF受体的表达量最高,疏肝法组次之,健脾法组最少;疏肝健脾法组、疏肝法组和健脾法组的肝干细胞WB-F344FGF受体表达量无显著性差异;疏肝健脾法组的肝干细胞WB-F344TGF-β受体表达量最高,疏肝法组和健脾法组的肝干细胞WB-F344TGF-β受体表达量无显著性差异。3.疏肝健脾法干预组肝干细胞表面标志物AFPmRNA在分化过程中逐渐减少,疏肝法和健脾法无疏肝健脾法干预组显著;疏肝健脾法干预组肝干细胞表面标志物ALBmRNA在分化过程中逐渐增多,疏肝法和健脾法无疏肝健脾法干预组显著。4.疏肝健脾法抑制凋亡作用最显著。5.有效建立了大鼠卵圆细胞增殖模型;疏肝健脾法能够促进HGFR、TGFR、EGFR、FGFR、CTGFR的表达,且显著优于疏肝法和健脾法。结论:1.疏肝健脾法（四逆散合四君子汤）、疏肝法（四逆散）、健脾法（四君子汤）均对肝干细胞的增殖具有促进作用,且成一定的量效关系,对肝干细胞未表现出毒性作用。2.疏肝健脾法可以使HGFR、EGFR、CTGFR、TGF-βR、FGFR的表达量上调,疏肝法和健脾法也可以使HGFR、EGFR、CTGFR、TGF-βR、FGFR的表达量上调但没有疏肝健脾法显著;3.疏肝健脾法可以通过细胞因子体系对肝干细胞的增殖、分化进行调节,疏肝健脾法可以促进肝干细胞向肝细胞的分化。4.疏肝健脾法具有抑制肝干细胞凋亡的作用,且作用优于疏肝法和健脾法。5.疏肝健脾法能够促进肝干细胞的增殖、分化,其作用是通过HGF、TGF、EGF、FGF、CTGF等细胞因子实现的。