来氟米特对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠足细胞nephrin表达的影响

论文摘要

第一部分:大鼠足细胞原代培养及鉴定目的:建立大鼠足细胞原代培养体系,为足细胞体外病理生理研究奠定基础,进一步探讨肾脏病可能发病机制。方法:选取健康雄性SD大鼠,重约100～150克,无菌取出肾脏,去除肾包膜,分离肾皮质,切割成小块并依次通过100目、150目、200目网筛,收集200目网筛上小球,完全培养基稀释后种植于无菌培养瓶内,37℃,5%二氧化碳湿性培养一周后,胰酶-EDTA消化后传代接种于盖玻片上,继续生长一周后鉴定。用抗WT-1,Nephrin抗体按下述间接免疫荧光法鉴定,上述两种蛋白同时为阳性的细胞为足细胞。抗Nephrin、WT-1抗体均为兔抗大鼠多克隆抗体,二抗为FITC标记的羊抗兔IgG。细胞种植于盖玻片上,冷丙酮固定20分钟,0.2%TritonX-100处理10分钟,3%牛血清白蛋白封闭,加适度稀释一抗4℃过夜（阴性对照用羊IgG代替一抗,其余处理相同）,然后加入二抗37℃孵育一小时,荧光显微镜观察拍照。结果:肾皮质过筛后收集200目网筛上组织于显微镜下可见包裹完整的肾小球,培养箱培养五天即可见小球周围爬出鹅卵石样结构足细胞,七天后传代过筛后种植于盖玻片上细胞经继续培养可见分化出足突样结构,呈树枝样分布。取出盖玻片,间接免疫荧光法鉴定,荧光显微镜观察可见阳性细胞呈绿色荧光,Nephrin分布于足细胞胞核、胞浆及胞膜,WT-1分布于细胞核,PI短暂染色可见大量红色细胞核,进一步定位上述两蛋白分布,同时阴性对照未见荧光。结论:选用细胞筛过筛后可以得到完整肾小球,经完全培养基培养后五天即有鹅卵石样细胞爬出,七天消化传代后分离细胞分化出足突样结构,呈树枝样分布。经间接免疫荧光进一步鉴定此细胞,足细胞特异性蛋白nephrin、WT-1均为阳性,阴性对照为阴性。依据此法建立的细胞体系为足细胞,且分化表达足细胞标志蛋白nephrin、WT-1。第二部分:血管紧张素Ⅱ足细胞损伤模型的建立及其对大鼠足细胞nephrin表达的影响目的:血管紧张素Ⅱ对足细胞损伤模型的建立,为体外研究其对足细胞nephrin表达的影响,进一步探讨肾脏病的可能机制。方法:采用原代培养的肾小球足细胞第二或三代,传代种植于六孔板,同时设置复孔,传代后继续培养至细胞分化,无血清同步后加入血管紧张素Ⅱ刺激,分别设置浓度梯度(10-4mol/L、10-6mol/L、10-8mol/L),共培养48小时;时间梯度,选用10-6mol/L浓度血管紧张素Ⅱ刺激24小时、48小时、72小时。选用TRIZOL试剂盒按标准步骤提取总RNA,RT-PCR法检测nephrin mRNA表达的变化。结果:细胞种植于六孔板,生长状态佳,细胞分化出足突样结构。细胞加入血管紧张素刺激,TRIZOL提取RNA经分光光度计测纯度和浓度后RT-PCR测定nephrin mRNA表达,可见血管紧张素Ⅱ刺激足细胞nephrin mRNA表达呈时间及剂量依赖性下调,随着浓度增加及时间延长,足细胞nephrin mRNA表达下调（P＜0.05）。结论:血管紧张素Ⅱ在体外条件下造成足细胞损伤,其可以明显下调足细胞滤孔隔膜蛋白nephrin mRNA的表达。第三部分:来氟米特活性成分A771726对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠nephrin表达下调的影响目的:探讨来氟米特治疗肾脏病的可能机制,为临床使用提供可靠依据。方法:采用原代培养的肾小球足细胞第二或三代,传代种植于六孔板,同时设置复孔,传代后继续培养至细胞分化,无血清同步后依次设置正常对照组、血管紧张素Ⅱ刺激组(10-6mol/L)、血管紧张素Ⅱ刺激加来氟米特治疗组(10-6mol/L),依次选用不同浓度A771726（0.3μg/ml、3μg/ml、30μg/ml）。选用TRIZOL试剂盒按标准步骤提取总RNA,RT-PCR法检测nephrin mRNA表达的变化。结果:血管紧张素Ⅱ下调nephrin mRNA表达,来氟米特体内活性成分可以部分纠正后者表达的下调,似呈剂量依赖性,即随着来氟米特浓度适度提高,其提高nephrin mRNA表达的作用增加（P＜0.05）。结论:血管紧张素Ⅱ下调足细胞滤孔隔膜蛋白nephrin mRNA的表达,来氟米特部分纠正血管紧张素Ⅱ对nephrin mRNA表达的影响。

论文目录

• 一、缩略词
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、第一部分:大鼠足细胞原代培养及鉴定
• 前言
• （一） 材料和方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 小结
• 参考文献
• 五、第二部分:血管紧张素Ⅱ足细胞损伤模型的建立及其对大鼠足细胞Nephrin表达的影响
• 前言
• （一） 材料和方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 小结
• 参考文献
• 六、第三部分:来氟米特活性成分A771726对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠Nephrin表达下调的影响
• 前言
• （一） 材料和方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 小结
• 参考文献
• 七、文献综述
• 综述:血管紧张素Ⅱ足细胞作用机制研究进展
• 参考文献
• 八、致谢