猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

论文摘要

猪圆环病毒（porcine circovirus, PCV）病是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪的传染病，与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍等多种病征有关，并且PCV2感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，加重发病程度。为对猪圆环病毒2型的临床诊断及流行病学调查提供简便、快速的试验方法和工具，本研究应用大肠杆菌原核表达系统对PCV2的Cap蛋白进行了重组表达，应用镍琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化重组蛋白后，以其为抗原建立了间接ELISA检测方法，并在建立的间接ELISA检测方法的基础上，研制了可用于临床检测的猪圆环病毒2型ELISA试剂盒。猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组表达及免疫原性分析：针对PCV2 ORF2基因编码的Cap蛋白具有PCV2的大部分抗原表位，用特异性引物扩增ORF2部分基因，该基因序列去掉了ORF2基因编码蛋白N端的信号肽基因序列，然后克隆入表达载体pET-32a（+），经E.coli BL21（DE3）用IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表明，成功表达出目的蛋白（40ku），目的蛋白能与猪PCV2阳性血清发生反应，具有反应原性。表明该重组Cap蛋白可作为包被抗原。猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的纯化及间接ELISA方法的建立：为使Cap蛋白得到最大程度的表达，通过试验表明最佳诱导温度、时间以及IPTG浓度分别为30℃、6h、1mmol/L，表达蛋白占菌体总蛋白的20.71%，经Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析纯化后重组蛋白浓度为679.34μg/mL。将经超声破碎、亲和层析柱纯化的Cap蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA检测方法：最佳抗原包被浓度为4μg/mL，包被时间为37℃1h+4℃过夜；封闭剂为5%脱脂奶粉，封闭时间为4℃过夜；一抗最佳稀释度为1︰100，作用时间为1h；二抗最佳稀释度为1︰8000，作用时间为1h；显色时间为5min。当血清P/N值大于0.3280时，为阳性；当血清P/N值小于0.2868时，为阴性；当P/N值介于0.3280、0.2868之间时，为可疑。与商品化试剂盒相比，其敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%；同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒无交叉反应。猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒的研制及初步应用：利用已建立的猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法研制ELISA检测试剂盒，并用同一批次和不同批次的试剂盒检测不同抗体效价的血清，结果变异系数均小于5%，表明具有较好的重复性；试剂盒在-20℃至少可保存1年以上。最后将试剂盒应用于临床血清样品的检测，结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为：100%、48.39%、100%。本研究为猪圆环病毒2型的临床诊断及流行病学调查提供了简便、快速的检测方法和工具，也为猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒的进一步商品化提供了技术资料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号表
• 第一章 绪论
• 1.1 PCV2 病原学
• 1.1.1 PCV2 的形态学特性与理化特性
• 1.1.2 PCV2 的培养特性
• 1.2 PCV2 分子病原学
• 1.2.1 PCV2 的基因组特性
• 1.2.2 PCV2 的复制与转录
• 1.2.3 PCV2 基因组编码蛋白及其特征
• 1.3 PCV2 的致病机理
• 1.3.1 PCV2 感染对免疫系统有明显影响
• 1.3.2 各种因素对 PCV2 感染的影响
• 1.4 PCV2 及相关疾病的临床症状与病理变化
• 1.4.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征
• 1.4.2 猪皮炎与肾病综合征
• 1.4.3 猪呼吸系统疾病综合征
• 1.4.4 母猪繁殖障碍
• 1.4.5 仔猪先天性震颤
• 1.5 PCV2 感染的诊断
• 1.5.1 病毒分离
• 1.5.2 间接免疫荧光试验
• 1.5.3 免疫过氧化物酶单层细胞试验
• 1.5.4 免疫组化技术
• 1.5.5 聚合酶链式反应
• 1.5.6 核酸探针及原位杂交技术
• 1.5.7 环介导等温扩增技术
• 1.5.8 酶联免疫吸附试验
• 1.5.9 胶体金免疫层析法
• 1.6 PCV2 感染的防制
• 1.7 研究目的和意义
• 第二章 猪圆环病毒2型 ORF2 基因的原核表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 PCR 扩增结果
• 2.2.2 ORF2 -T 的鉴定结果
• 2.2.3 ORF2- pET - 32a 的鉴定结果
• 2.2.4 表达产物的SDS -PAGE 电泳结果
• 2.2.5 表达产物的Western blotting 鉴定结果
• 2.3 讨论
• 第三章 猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组 Cap 蛋白表达优化结果
• 3.2.2 重组 Cap 蛋白的纯化
• 3.2.3 浓缩重组 Cap 蛋白的定量
• 3.2.4 间接 ELISA 方法的建立及条件优化结果
• 3.2.5 间接 ELISA 方法阴阳性判定标准的建立
• 3.2.6 交叉反应试验结果
• 3.2.7 敏感性、特异性和符合率试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 猪圆环病毒2 型间接 ELISA 抗体检测试剂盒的研制及初步应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 批内、批间重复性检测结果
• 4.2.2 3 7 ℃加速老化试验结果
• 4.2.3 4 ℃和- 2 0℃恒温保存试验结果
• 4.2.4 临床血清样本的检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历