诺氟沙星和三氯生对剑尾鱼的毒性效应

论文摘要

PPCPs（Pharmaceuticals and personal care products）在生态系统中具有较强的持久性、生物活性、生物累积性和缓慢生物降解性,由于其特殊的物化特性及大量被使用的现状,给人类健康和生态环境带来潜在风险。PPCPs进入生物体,必然引起机体的防御和代谢反应,这些反应首先是在分子和细胞水平上体现。CYP 1A、CYP 3A、GST和P-gp是生物体细胞内参与PPCPs等环境污染物代谢的酶或蛋白,它们在基因和蛋白水平上的变化可作为良好生物标志物对生物体所处的污染状态和潜在危险进行预警。本研究选取PPCPs中具有代表性的诺氟沙星（Norfloxacin, NFLX）和三氯生（Triclosan, TCS）为研究药物,通过研究其对剑尾鱼肝脏Ⅰ相代谢酶、Ⅱ相代谢酶活性及其mRNA表达水平和P-gp mRNA表达的影响,探讨NFLX与TCS对水环境存在的潜在危害,为其使用的生态风险评估提供实验依据。主要研究内容包括：（1）利用RT-PCR法对剑尾鱼CYP 3A cDNA进行克隆。获得大小为582bp核心片段,编码194个氨基酸；该片段编码的氨基酸与底鳉CYP 3A的同源性最高,为90%,与其它鱼类CYP 3A的同源性均大于65%,与哺乳动物的同源性接近60%。表明,所克隆的基因片段为剑尾鱼CYP 3A基因。（2）根据已获得的剑尾鱼P-actin、GST、CYP 1A、CYP 3A和P-gp cDNA序列设计特异性引物,建立这些基因实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,5个基因的质粒标准品扩增的标准曲线线性关系均良好,相关系数R2为0.9971-0.9999,扩增效率为95%-105%;批内批间试验的变异系数均小于2%。建立的剑尾鱼GST、P-gp、CYP 1A与CYP 3A基因的实时荧光定量PCR检测方法具有简便、敏感、稳定、高效等优点,适用于样品的检测。（3）通过实时荧光定量PCR方法检测GST, CYP 1A、CYP 3A和P-gp mRNA的相对表达量,同时测定GST、EROD、ERND酶活性来研究NFLX对剑尾鱼的影响。结果表明,剑尾鱼Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶活性及其mRNA相对表达量、P-gp mRNA相对表达量均对NFLX具有响应,受到诱导或抑制,基因水平的响应较蛋白水平的敏感,且雌、雄鱼间存在差异；EROD酶活性及CYP 1A mRNA的相对表达量对NFLX的响应较敏感,适合作为NFLX暴露的生物标志物,可对NFLX环境污染进行预警。（4）采用体外暴露的方式研究TCS对剑尾鱼的急性毒性效应,结果显示,TCS对剑尾鱼的96h半致死浓度（LC50）为1.47 mg·L-1,属于高毒。TCS在0.002-1.25 mg·L-1范围内,剑尾鱼GST、EROD、ERND活性及GST、CYP 1A、CYP 3A mRNA相对表达量、P-gp mRNA相对表达量均有响应,受到抑制或诱导,且存在性别差异；GST活性及其mRNA相对表达量对TCS的响应较敏感,适合作TCS暴露的生物标志物,能敏感地反映TCS对水生态环境的潜在危害,为TCS的生态风险评价提供重要的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 PPCPs的概念
• 1.1.1 水环境中PPCPs的来源及其污染状况
• 1.1.2 PPCPs对水环境的影响
• 1.2 研究药物
• 1.2.1 诺氟沙星（NFLX）
• 1.2.2 三氯生（TCS）
• 1.3 实验动物剑尾鱼
• 1.4 生物标志物及其研究现状
• 1.5 研究内容、目的和意义
• 1.6 研究技术路线
• 第二章 剑尾鱼细胞色素P450 3A中间序列的克隆与分析
• 2.1 材料与仪器设备
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 试剂药品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 剑尾鱼CYP 3A的诱导
• 2.2.2 肝脏总RNA的提取
• 2.2.3 CYP 3A中间序列的克隆
• 2.2.4 序列分析与系统树的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 剑尾鱼肝脏总RNA的提取
• 2.3.2 剑尾鱼CYP 3A中间序列的克隆
• 2.3.3 剑尾鱼CYP 3A基因cDNA序列及同源性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 剑尾鱼CYP 3A、CYP 1A、GST、P-gp基因定量检测方法的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 仪器设备与试剂药品
• 3.1.3 引物设计与合成
• 3.1.4 cDNA的合成
• 3.1.5 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立
• 3.1.6 数据处理方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 质粒标准品的制备
• 3.2.2 标准曲线的建立及线性检测范围
• 3.2.3 重复性试验
• 3.3 讨论
• 3.3.1 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的特异性与重复性
• 3.3.2 本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的准确性与适用性
• 3.4 结论
• 第四章 诺氟沙星对剑尾鱼的毒性效应
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 仪器设备
• 4.1.3 试剂药品
• 4.1.4 试剂的配制
• 4.1.5 实验方法
• 4.1.6 数据处理
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同浓度NFLX对剑尾鱼GST活性及GST mRNA表达的影响
• 4.2.2 不同浓度NFLX对剑尾鱼EROD活性及CYP 1A mRNA表达的影响
• 4.2.3 不同浓度NFLX对剑尾鱼ERND活性及CYP3A mRNA表达的影响
• 4.2.4 不同浓度NFLX对剑尾鱼P-gp mRNA表达的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 剑尾鱼酶活性与mRNA表达的相关性分析
• 4.3.2 NFLX对剑尾鱼肝脏Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶及mRNA表达的影响
• 4.3.3 剑尾鱼对药物响应的性别差异
• 4.4 结论
• 第五章 三氯生对剑尾鱼的毒性效应
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 仪器设备
• 5.1.3 试剂药品与试剂的配制
• 5.1.4 实验方法
• 5.1.5 数据处理与分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 TCS对剑尾鱼的毒性
• 5.2.2 不同浓度TCS对剑尾鱼GST活性及GST mRNA表达的影响
• 5.2.3 不同浓度TCS对剑尾鱼EROD活性及CYP 1A mRNA表达的影响
• 5.2.4 不同浓度TCS对剑尾鱼ERND酶活性及CYP 3A mRNA表达的影响
• 5.2.5 不同浓度TCS对剑尾鱼P-gp mRNA表达的影响
• 5.3 讨论
• 5.3.1 TCS对剑尾鱼的急性毒性
• 5.3.2 TCS对剑尾鱼酶活性及mRNA表达的影响
• 5.4 结论
• 第六章 总结和展望
• 参考文献
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢