小麦抗条锈病相关NAC转录因子基因的克隆及特征分析

论文摘要

由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia sriiformis f. sp. trittici）引起的小麦条锈病是影响小麦生产上最重要的病害之一。小麦条锈病具有分布广、传播速度快等特点,其大规模暴发会造成小麦产量大幅度下降,乃至绝收。国内外研究和实践表明,选育并合理利用抗锈品种是控制小麦条锈病安全、有效、经济的方法。解析小麦与条锈菌的分子互作关系,揭示寄主植物的抗病转录调控机制,对于小麦条锈病的可持续防治具有重要的理论意义。NAC转录因子是一类植物特异性的转录因子,其在调节植物发育以及识别环境刺激方面发挥着重要作用。NAC家族蛋白的特点是,在其氨基酸N-端具有高度保守具有DNA结合功能的NAC结构域,而氨基酸的C-端则是具有多样性的转录激活域。本文分别以水稻OsNAC4和OsNAC8基因的cDNA序列为基础,利用电子克隆、RT-PCR和RACE技术,从条锈菌侵染的水源11叶片cDNA中分离到两个受条锈菌诱导的小麦NAC转录因子基因,命名为TaNAC4（GenBank No. GQ985329）和TaNAC8（GenBank No. GU001723）,并对他们的分子特征进行分析。TaNAC4全长cDNA序列为1076bp,包含一个927bp的完整开放阅读框,编码一条由308个氨基酸组成的多肽,其N-端具有NAC保守结构域（24-179 aa）。TaNAC4与OsNAC4同源性为69%。酵母单杂交研究结果表明,TaNAC4蛋白C端具有转录激活功能。亚细胞定位实验发现,TaNAC4蛋白分布在洋葱表皮细胞核内。实时定量PCR分析显示,TaNAC4在小麦根中的表达量高于茎和叶中;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TaNAC4受条锈菌诱导上调,在亲和互作中,24 h的表达量仅为0 h的2倍左右;外源激素乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）处理激活TaNAC4上调,TaNAC4同时受高盐、伤害以及低温等非生物胁迫因子的诱导。TaNAC8全长cDNA序列为1996bp,开放阅读框为1446bp,编码的蛋白有481个氨基酸,其N-端具有NAC保守结构域（9-159 aa）,C-端具有一个跨膜结构域（451-470 aa）。TaNAC8与OsNAC8同源性为53%。酵母单杂交研究结果表明,TaNAC8蛋白的C端具有转录激活功能。实时定量PCR分析显示,TaNAC8在小麦茎中的表达量低于其在根和叶组织中的表达量;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TaNAC8受条锈菌诱导上调表达,而在亲和组合中没有明显的变化;TaNAC8受外源激素MeJA、ET的诱导快速上调,同时受高盐、干旱及低温等非生物物胁迫因子诱导表达。以上研究结果表明TaNAC4和TaNAC8编码的转录因子具有转录激活功能,他们可能通过ET/JA信号途径介导小麦对环境胁迫的抵抗作用和对条锈病的防御反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦条锈病的危害及研究现状
• 1.1.1 小麦条锈病的危害
• 1.1.2 小麦条锈病的研究现状
• 1.2 植物抗病的分子机制
• 1.2.1 植物过敏性反应研究进展
• 1.2.2 植物抗病基因介导的信号途径
• 1.3 植物转录因子研究进展
• 1.3.1 植物中的转录因子
• 1.3.2 植物转录因子的结构
• 1.3.3 植物转录因子的分类
• 1.3.4 NAC 转录因子研究进展
• 1.3.4.1 NAC 转录因子的分类
• 1.3.4.2 NAC 转录因子的功能
• 1.4 研究的目的及意义
• 第二章 小麦TaNAC4 转录因子基因的克隆及特征分析
• 2.1 材料、试剂及仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试菌种和小麦品种、载体、菌株
• 2.1.1.2 培养和处理
• 2.1.1.3 取样
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦叶片总RNA 的提取与质量检测
• 2.2.1.1 小麦叶片总RNA 的提取
• 2.2.1.2 总RNA 浓度、纯度及完整性检测
• 2.2.2 cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 电子克隆
• 2.2.4 RT-PCR 验证
• 2.2.4.1 引物的设计与合成
• 2.2.4.2 RT-PCR 克隆
• 2.2.5 PCR 产物的回收纯化
• 2.2.6 PCR 产物与载体的连接
• 2.2.7 感受态细胞的转化
• 2.2.8 质粒DNA 的小量制备
• 2.2.9 序列分析
• 2.2.9.1 相似性和同源性搜索
• 2.2.9.2 氨基酸序列分析
• 2.2.9.3 进化树分析
• 2.2.10 亚细胞定位
• 2.2.11 TaNAC4 基因转录激活作用验证
• 2.2.11.1 转录激活载体的构建
• 2.2.11.2 酵母感受态细胞的制备
• 2.2.11.3 转化酵母感受态细胞
• 2.2.11.4 转化后的酵母感受态细胞显色
• 2.2.12 表达特征分析
• 2.2.12.1 RNA 的提取
• 2.2.12.2 cDNA 第一链的合成
• 2.2.12.3 实时定量PCR 分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 小麦叶片总RNA 的提取
• 2.3.2 TaNAC4 的全长cDNA 克隆
• 2.3.3 RT-PCR 验证
• 2.3.4 小麦TaNAC4 基因的序列分析
• 2.3.4.1 序列同源性分析
• 2.3.4.2 TaNAC4 编码蛋白的功能位点及结构域分析
• 2.3.4.3 多序列比对及进化树构建
• 2.3.4.4 亚细胞定位分析
• 2.3.4.5 转录激活验证
• 2.3.4.6 实时定量PCR 分析
• 2.4 讨论
• 第三章 小麦TaNAC8 转录因子基因克隆及特征分析
• 3.1 材料、试剂及仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 电子克隆
• 3.2.2 RT-PCR 验证
• 3.2.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2.2 RT-PCR 克隆获得EST 序列
• 3.2.2.3 RACE 技术克隆基因全长
• 3.2.3 序列分析
• 3.2.4 转录自激活作用
• 3.2.5 表达特征分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 电子克隆结果
• 3.3.2 RT-PCR 验证
• 3.3.3 RACE 方法克隆TaNAC8 的全长cDNA
• 3.3.4 小麦TaNAC8 基因的序列分析
• 3.3.4.1 序列同源性分析
• 3.3.4.2 TaNAC8 编码蛋白的功能位点及结构域分析
• 3.3.4.3 多序列比对及进化树构建
• 3.3.4.4 转录激活验证
• 3.3.4.5 实时荧光定量PCR 分析
• 3.5 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介