鸡精原干细胞和支持细胞的分离培养与鉴定

论文摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是指位于曲精细管基膜上既能自我更新又能定向分化产生精母细胞直至精子的一类原始精原细胞,而支持细胞(sertoli cells,SCs)作为生精上皮中的唯一体细胞,对SSCs起着重要的支持和营养作用。有关禽类SSCs的研究还很不成熟,而禽类睾丸SCs的分离培养至今未见正式报道。本研究以出雏20~30天的公鸡睾丸和孵化18天的鸡胚睾丸为实验材料,采用两步酶消化法分离获得睾丸细胞悬液,对SSCs采用不同温度、不同密度和不同饲养层的培养方法进行培养,以期建立适宜鸡SSCs体外长期存活的培养体系,同时对培养的SSCs生物学特性进行了鉴定,并利用培养的SSCs进行了体内移植分化实验,而对于SCs则进行了分离纯化、原代和传代的培养与鉴定。研究结果总结如下:1.两步酶消化法分离获得的睾丸细胞活率达95%以上,是睾丸组织适宜的消化方法。2. 37℃和38.5℃下,鸡SSCs都能很好地生长,并能形成增殖,两者的培养结果差异不显著(P>0.05),但38.5℃下除鸡SSCs生长更迅速外,SCs等其他细胞生长也更迅速,反而会抑制鸡SSCs的生长,因此37℃更适宜作为鸡SSCs的培养温度。3. 5×10~5cell/mL接种密度的培养效果明显优于1×10~5cell/mL的培养效果(P<0.05),而与1×10~6cell/mL的培养结果之间差异不显著(P>0.05),但5×10~5cell/mL的增殖率高于1×10~6cell/mL的增殖率,更适宜作为鸡SSCs体外培养的接种密度。4. CEF和SCs两种饲养层细胞的培养结果之间差异不显著(P>0.05),但SCs饲养层培养24h的细胞数、培养96h的细胞数和增殖率均略高于CEF饲养层培养的结果,因此SCs更适合作为鸡SSCs体外培养的饲养层细胞。5.经AKP染色法、PAS染色法和免疫化学染色鉴定,体外培养的鸡SSCs仍保持着未分化的特性,说明我们的培养体系适合作为鸡SSCs体外培养方法,且这几种鉴定方法简单方便,适合作为鸡SSCs的鉴定方法。6.皮下移植的成功率显著高于肌肉移植和心脏移植的成功率(P<0.05),因此,皮下是体内移植分化的理想部位,同时体内分化试验首次证明禽类SSCs具有多向分化潜能。7.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,可去除绝大部分的性原细胞,从而获得纯度约为90%的单层SCs,并成功地进行了传代培养;AKP染色法、油红O染色法、吖啶橙染色法和罗丹明123染色法等方法简单易行,是鉴定睾丸SCs的理想方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 精原干细胞研究概况
• 1.1.1 精原干细胞的概念及其来源
• 1.1.2 精原干细胞的生物学特性与鉴定
• 1.1.3 精原干细胞分离纯化
• 1.1.4 精原干细胞的体外培养影响因素
• 1.1.5 精原干细胞移植及其介导的转基因
• 1.1.6 精原干细胞的分化潜能
• 1.1.7 精原干细胞的应用
• 1.2 支持细胞
• 1.2.1 支持细胞概念
• 1.2.2 支持细胞的分离纯化
• 1.2.3 支持细胞的培养
• 1.2.4 支持细胞的鉴定
• 1.2.5 支持细胞永生株的建立
• 1.2.6 支持细胞的应用
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.3 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 两步酶消化法的结果
• 3.2 精原干细胞原代培养过程中不同温度下的培养结果
• 3.3 精原干细胞原代培养过程中不同密度下的培养结果
• 3.4 精原干细胞传代培养过程中不同饲养层的培养结果
• 3.5 精原干细胞的鉴定结果
• 3.6 支持细胞的原代培养和鉴定
• 3.7 支持细胞的传代培养和鉴定
• 4 讨论
• 4.1 两步酶消化法对分离细胞的影响
• 4.2 不同培养条件对培养结果的影响
• 4.2.1 培养温度对培养结果的影响
• 4.2.2 培养密度对培养结果的影响
• 4.2.3 饲养层细胞对培养结果的影响
• 4.3 精原干细胞的鉴定比较
• 4.4 移植分化的检测比较
• 4.5 支持细胞的鉴定比较
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文